IL-17基因轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的建立及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、目的:最近幾年,生物治療已成為一種新型的腫瘤治療方法,并越來(lái)越受到人們的重視。其中細(xì)胞因子基因治療是腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn),通過(guò)將不同的細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤或免疫效應(yīng)細(xì)胞,使其在機(jī)體表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或者通過(guò)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能以加速腫瘤的消退。IL-17是目前新發(fā)現(xiàn)的主要由CD4+記憶性T淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞等分泌的一種細(xì)胞因子,其在天然免疫和宿主防御中有特殊功能,在炎癥反應(yīng)中對(duì)白細(xì)胞的遷移和活化、細(xì)胞增殖分化、生物因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、免疫

2、調(diào)節(jié)及腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用。但有關(guān)IL-17的作用機(jī)理等許多問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建表達(dá)IL-17基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞株,建立荷瘤小鼠模型,研究IL-17基因的生物活性及其抗腫瘤效應(yīng)。
　　 方法:1 IL-17基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將插入IL-17基因的pcDNA3.1載體導(dǎo)入小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1,同時(shí),將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后獲得表達(dá)IL-17的

3、陽(yáng)性細(xì)胞克隆(4T1/IL-17)。
　　 2用光學(xué)顯微鏡觀察4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞的形態(tài)變化,RT-PCR檢測(cè)IL-17基因的表達(dá),激光共聚焦和Western-blot法檢測(cè)IL-17蛋白的表達(dá)。
　　 3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MTS法分析4T1/IL-17細(xì)胞體外增殖反應(yīng),繪制生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率的變化以及細(xì)胞表面MHCI、MHCII、LFA-1等分子表達(dá)的情況。

4、　　 4 IL-17誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生IL-6 ELISA法檢測(cè)4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6水平。
　　 5建立荷瘤動(dòng)物模型,將4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞分別接種于小鼠右側(cè)背部皮下,觀察三種細(xì)胞移植瘤在小鼠體內(nèi)成瘤性、生長(zhǎng)情況及小鼠生存期的變化。接種腫瘤細(xì)胞6周后分別取三組小鼠脾臟和腫瘤組織,用乳酸脫氫酶法、

5、MTS法分別檢測(cè)三組小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷活性、脾細(xì)胞增殖反應(yīng)情況。用ELISA法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞經(jīng)刺激后產(chǎn)生IFN-γ、IL-12的情況;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)4T1/IL-17細(xì)胞接種于小鼠體內(nèi)的細(xì)胞凋亡情況及腫瘤組織細(xì)胞表面MHCI、MHCII、LFA-1等分子表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:1以質(zhì)粒pcDNA3.1為載體成功將IL-17基因轉(zhuǎn)染至小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1,建立表達(dá)IL-17的細(xì)胞株4T1/IL-17,該細(xì)胞可產(chǎn)生和分泌I

6、L-17分子。光鏡下觀察三種細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示4T1/IL-17細(xì)胞有IL-17基因的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡和Western-blot分析結(jié)果證明,4T1/IL-17細(xì)胞中有IL-17蛋白表達(dá),而4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞未見(jiàn)IL-17蛋白表達(dá),從而在基因和蛋白水平證明,成功建立了轉(zhuǎn)染IL-17基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞株。
　　 24T1/IL-17細(xì)胞培養(yǎng)上清可刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7

7、產(chǎn)生IL-6,IL-6水平明顯高于4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞培養(yǎng)上清的作用(P＜0.01)。
　　 34T1/IL-17細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)與4T1/pcDNA3.1和4T1細(xì)胞無(wú)明顯差別(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染IL-17基因不影響細(xì)胞劇期和細(xì)胞凋亡,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)4T1/IL-17和4T1/pcDNA3.1細(xì)胞表面MHCI、MHCII、LFA-1的表達(dá)水平與4T1細(xì)胞相比沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　

8、 4將4T1/IL-17細(xì)胞接種小鼠體內(nèi)后,荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度、體積和重量均明顯小于4T1/pcDNA3.1細(xì)胞組及4T1細(xì)胞組,生存時(shí)間也明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　 5與4T1/pcDNA3.1及4T1細(xì)胞組荷瘤小鼠相比,接種4T1/IL-17細(xì)胞組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.05)。接種4T1/IL-17細(xì)胞組小鼠腫瘤組織細(xì)胞表面MHCI、MHCII、LFA-1分子表達(dá)水平顯著性增高(P＜0.01)。

9、r>　　 6接種各組腫瘤細(xì)胞6周后,4T1/IL-17細(xì)胞組小鼠脾細(xì)胞的CTL殺傷活性及對(duì)ConA刺激的細(xì)胞增殖反應(yīng)性均明顯高于接種4T1/pcDNA3.1及4T1細(xì)胞組(P＜0.01);此外,接種4T1/IL-17細(xì)胞組小鼠脾細(xì)胞可產(chǎn)生高水平的IFN-γ、IL-12,明顯高于接種4T1/pcDNA3.1及4T1細(xì)胞組,有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染IL-17基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞株(4T1/IL-17