粘附分子在大鼠骨髓間充質干細胞的表達及其意義.pdf

1、研究背景： 骨髓中除了造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)以外還有一種干細胞，由于其來源于間充質，并具有間充質細胞的分化潛力，故稱之為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)；由于其在骨髓中可分化為支持造血細胞的基質細胞，故又稱之為基質干細胞(Stromal stem cells)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞具有可塑性，在特定的條件下可分化為各胚層來源的組

2、織細胞，稱為橫向分化(transdifferentiation)，這一發(fā)現(xiàn)不僅對于細胞生物學理論的發(fā)展有重大意義，對于各種因素導致的組織和器官缺損性、退行性病變以及遺傳缺陷性疾病的細胞替代治療也具有深遠的影響。另外，由于骨髓MSCs易于分離培養(yǎng)和體外擴增，可自體移植無免疫排斥反應等特點，因此近年來骨髓MSCs替代治療已成為醫(yī)學界乃至整個生命科學領域的研究熱點。 目前，骨髓MSCs替代治療方式主要有兩種：一種是自體動員，另一種是細

3、胞移植。不論是動員還是移植骨髓MSCs，其與血管內皮細胞或組織細胞及細胞外基質的粘附都是其發(fā)揮修復治療作用首要的一步。因此，探討骨髓MSCs的生物學及分子學基礎就顯得尤為重要。研究證明粘附分子在細胞與細胞、細胞與細胞外基質問粘附過程中起著重要的作用，然而其在骨髓間充質干細胞中的表達及其意義目前尚無統(tǒng)一認識。目前，大鼠作為最常用來研究干細胞分化、移植的實驗動物之一，其骨髓MSCs粘附分子表達的研究報道甚少。骨髓MSCs分離培養(yǎng)和體外擴增是

4、進行骨髓MSCs研究的前提，因此，我們設計并進行了如下兩部分實驗研究： 第一部分： 細胞外基質對大鼠骨髓間充質干細胞生長特性的影響目的：觀察細胞外基質--多聚賴氨酸對大鼠骨髓間充質干細胞(rat marrowmesenchymal stem cells，rMSCs)生長特性的影響，探討骨髓間充質干細胞的提取、分離培養(yǎng)和體外擴增的最佳條件。 方法： 采用全骨髓直接貼壁法獲得原代rMSCs，分別接種于涂布和未

5、涂布多聚賴氨酸的培養(yǎng)器皿上，顯微鏡下觀察細胞生物學形態(tài)及生長狀態(tài)，計數(shù)不同時間細胞貼壁數(shù)目，流式細胞術分析細胞周期。 結果： rMSCs在用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)器皿上貼壁、增殖都較普通組快，細胞形態(tài)好，傳代細胞呈均一的長梭形，呈漩渦狀或梳狀生長，為典型的MSCs形態(tài)；細胞活力和長勢較普通組活躍。 結論： (1)細胞外基質多聚賴氨酸能明顯促進rMSCs的貼壁和增殖，有助于rMSCs的體外擴增培養(yǎng)。

6、 (2)本實驗方法能比較容易地獲得大量高純度的MSCs。 第二部分： VCAM-1、ICAM-1在大鼠骨髓問充質干細胞中的表達及其意義目的：探討血管細胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-l，VCAM-1)與細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在大鼠間充質干細胞中的表達及其意義。 方法： 采用第一部分的培養(yǎng)

7、方法獲得rMSCs，將培養(yǎng)的rMSCs分為兩組，其中一組用濃度為10 ng/ml的TNF-α 12 h，另外一組不加任何細胞因子作為空白對照。然后分別采用免疫細胞化學方法從蛋白水平對VCAM-1和ICAM-1進行定位分析，免疫熒光直標法在流式細胞儀上檢測細胞表面VCAM-1、ICAM-1的表達率，RT-PCR法檢測細胞VCAM-1、ICAM-1 mRNA的表達。 結果： 生理狀態(tài)下，rMSCs較低表達VCAM-1，而完全