全反式維甲酸對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞模型，將不同濃度的atRA與BMSCs共同孵育不同的時(shí)間，通過(guò)嚴(yán)格的體外實(shí)驗(yàn)，觀察atRA作用后BMSCs細(xì)胞的活力及細(xì)胞表面CD54、CD106表達(dá)的變化。以探討其在體外水平上atRA對(duì)CD54、CD106表達(dá)的影響，為該藥在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：調(diào)整BMSCs細(xì)胞濃度為5×103/ml，接種于96孔板，每種濃度設(shè)3個(gè)平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％FCS的DMEM-LG

2、培養(yǎng)基。加入不同濃度的atRA(空白對(duì)照組為O，A組為0.01μmol/L，B組為0.1μmol/L，C組為1.0μmol/L，D組10.0μmol/L)，在37℃，5％CO2飽和濕度下CO2孵箱內(nèi)共同孵育。采用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)BMSCs細(xì)胞存活率。在不同時(shí)間(12h，24h，48h，96h)，每孔加MTT(5g/L)10μl孵育4h，吸棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)50μl，振蕩10min，充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于45

3、0nm處測(cè)定吸光度(A)值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，以檢測(cè)BMSCs細(xì)胞存活率；另外調(diào)整BMSCs細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種于6孔板，每種濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，每孔總體系為2.5ml。加入不同濃度的atRA(空白對(duì)照組為O，A組為0.01μmol/L，B組為0.1μmol/L，C組為1.0μmol/L，D組10.0μmol/L)，在37℃，5％CO2飽和濕度下CO2孵箱內(nèi)共同孵育。在不同時(shí)間(12h，24h，48h，96h)把消化的細(xì)胞離心后

4、將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/ml，同時(shí)加入CD54-PE及CD106-FITC單抗各10μl，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度。 結(jié)果：1)在本實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)條件下，用MTT法觀察不同濃度atRA處理12h，24h，48h，96h對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明atRA濃度為0.01μmol/L時(shí)對(duì)BMSCs增殖抑制與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)；atRA濃度為0.1μmol/L-10.0μmol/L時(shí)

5、對(duì)BMSCs增殖抑制與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)；且在相同作用時(shí)間下，atRA對(duì)BMSCs細(xì)胞的增殖抑制作用隨atRA濃度的升高而升高；當(dāng)在相同的atRA作用濃度下，BMSCs細(xì)胞的增殖抑制作用隨atRA作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，atRA濃度為0.1μmol/L-10.0μmol/L作用時(shí)間12h、24h、48h、96h組間比較有顯著差異(P＜0.05)。 2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD54、CD106平均熒光強(qiáng)度。a

6、tRA濃度為0.01μmol/L-10.0μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞表面CD54、CD106的作用與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)；且在相同作用時(shí)間下，atRA對(duì)BMSCs細(xì)胞CD54、CD106的作用隨atRA濃度的升高而升高；當(dāng)在相同的atRA作用濃度下，atRA對(duì)BMSC細(xì)胞CD54、CD106的作用隨atRA作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；atRA濃度為0.01μmol/L-10.0μmol/L時(shí)12h、24h、48h、96h組間比較

7、有顯著差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1)atRA對(duì)BMSCs細(xì)胞有增殖抑制作用，濃度梯度為0.1μmol/L-10.0μmol/L作用在12-96h時(shí)段時(shí)，其作用表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴(lài)性，有利于指導(dǎo)臨床用藥。 2)atRA對(duì)BMSCs細(xì)胞有上調(diào)CD54、CD106的作用：濃度梯度為0.01μmol/L-10.0μmol/L時(shí)，作用隨藥物濃度升高而增強(qiáng)；上調(diào)作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，atRA作用在12小時(shí)即可發(fā)生，48-96小