骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠IgA腎病修復(fù).pdf

1、研究背景： IgA腎病(IgAN)是一組多病因引起的具有相同免疫病理學(xué)特征的慢性腎小球疾病，它是指以IgA或IgA為主的免疫球蛋白彌漫沉積在腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢，而臨床表現(xiàn)和病理改變各異的臨床-病理綜合征。IgAN的發(fā)病機制仍未完全明了，目前認(rèn)為感染、免疫反應(yīng)、炎癥介質(zhì)、遺傳與其發(fā)病相關(guān)。不管始動因素如何，有一點是肯定的，它是一組免疫性疾病，在其病情進(jìn)展中，免疫、炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)積聚等起著重要作用。目前認(rèn)為在廣泛應(yīng)用腎活

2、檢技術(shù)的國家，本病是最常見的慢性腎小球疾病。IgAN并非一種良性病變，大約30％的患者于發(fā)病后20年出現(xiàn)終末期腎病(ESRD)，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭(CRF)最常見的原因之一。因此，臨床上迫切需要可以延緩IgAN進(jìn)展，減少尿毒癥發(fā)生的治療方法。 目的： 鑒于MSCs的臨床應(yīng)用潛能，本研究將體外擴增的異體MSCs輸入IgA腎病大鼠體內(nèi)，觀察是否有MSCs歸巢于腎內(nèi)，是否影響IgA腎病的進(jìn)程，有無治療作用，并試探討其可能的機

3、制。 方法： 1.動物分組及模型的建立健康雌性SD大鼠，體重180-200g，均為SPF級，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。在恒溫清潔環(huán)境飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表隨機選出大鼠分為3組，每組各為12只：1、MSC組：IgA腎病制模成功后，于第11周初每只大鼠尾靜脈輸注約2×106個MSCs；2、生理鹽水(NS)組：制模成功后同期注射0.5ml生理鹽水；3、正常對照組：正常飼養(yǎng)對照，不予制模。根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實驗改良，IgA腎病模型

4、的建立采用口服牛血清白蛋白(BSA)+葡萄球菌腸毒素B(SEB)+皮下注射四氯化碳(CCL4)的方法，10周制模成功。 2.骨髓MSCs的體外培養(yǎng)和標(biāo)記取SD雄性大鼠，160g-180g，用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)原代細(xì)胞。24h后全量換液，以后每3d半量換液，細(xì)胞均勻鋪滿瓶壁(>80％)接種傳代。 MSCs傳至第5代后每天摻入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)以標(biāo)記細(xì)胞，每次摻入的終濃度10μmol/l。孵育細(xì)胞至80％融合，在

5、輸注前30min內(nèi)收集，用生理鹽水懸浮細(xì)胞。 3.大鼠骨髓MSCs的鑒定MSCs的表面抗原測定：收集第5代細(xì)胞，用CD45、CD90直接免疫熒光染色，并設(shè)FITC標(biāo)記的小鼠IgG1作陰性對照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。 MSCs的成骨成脂誘導(dǎo)分化：MSCs傳至第5代，接種至六孔板，制作細(xì)胞爬片，細(xì)胞孔板內(nèi)融合后分別加入成脂和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液。用OilRed染色脂肪細(xì)胞。用茜素紅法和細(xì)胞堿性磷酸酶法染色鑒定成骨細(xì)胞。 4.

6、標(biāo)本采集 每日觀察精神、飲食、大小便情況，每周給予稱重。于11周末及14周末分別從各組中隨機取6只大鼠，麻醉后腹主動脈取全血。均摘取左側(cè)腎臟，取外圍的腎皮質(zhì)一部分做冰凍切片做免疫熒光IgA檢測；一部分凍存于液氮，以待提取RNA；余下部分切片留做光鏡檢查及免疫組化。 5.血清學(xué)及尿蛋白檢測腎功能檢測采血后以10％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝，離心分離血清。用全自動生化分析儀測Cr、Bun。 尿蛋白檢測分別于10

7、周、11周、14周末將各組大鼠裝入代謝籠，收集24h尿，離心取上清。用考馬斯亮藍(lán)法檢測24小時尿蛋白定量。 6.腎組織學(xué)檢查及損傷評分腎組織經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后，HE、PAS染色行光鏡檢查，雙盲法觀察病理組織學(xué)改變。利用IPP6.0圖像分析軟件計算出腎小球系膜區(qū)占整個毛細(xì)血管叢面積的比值，以此比值的均值進(jìn)行統(tǒng)計。 IgA免疫熒光：新鮮腎組織冰凍切片，滴加山羊抗大鼠的FITC-IgA，熒光顯微鏡觀察攝影。免疫熒光強度分

8、級：參照目前國內(nèi)外通用的半定量5級法(0～4+)分級：低倍鏡下不能顯示，高倍鏡下似乎可見為一；低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見為+；低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見為++；低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼為+++；高倍鏡下刺眼為++++。 7.TGF-β1、MCP-1細(xì)胞因子的檢測尿ELISA檢測：大鼠24小時尿液中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)和單核/巨噬細(xì)胞趨化因子(MCP-1)的含量分別采用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測。 免

9、疫組織化學(xué)染色：腎組織4μm石蠟切片依據(jù)文獻(xiàn)方法行免疫過氧化物酶染色。使用下列第一抗體：單克隆小鼠抗大鼠TGF-β1抗體檢測組織TGF-β1的表達(dá)；多克隆兔抗鼠MCP-1抗體檢測組織MCP-1的表達(dá)。采用文獻(xiàn)提供的半定量法評價腎組織TGF-β1，MCPβ1表達(dá)的程度。 RT-PCR檢測腎皮質(zhì)MCP-1、TGF-β1mRNA水平的表達(dá)：組織液氮保存后，提取總RNA，使用兩步法試劑盒進(jìn)行RT-PCR。2％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析

10、系統(tǒng)掃描，特異性條帶用光密度半定量法分析，計算目的基因與GAPDH(內(nèi)參)光密度的比值。 8.觀察MSCs在腎臟中的分布使用免疫組化法觀察BrdUJ標(biāo)記的MSCs在腎臟中的分布情況。高倍鏡下分別觀察計數(shù)腎小球及小管區(qū)的陽性細(xì)胞，取其平均值作為計數(shù)結(jié)果。 統(tǒng)計分析： 采用SPSS11.0版統(tǒng)計軟件包，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組之間比較采用析因分析，同一觀察時間點各組之間采用單因素方差分析LSD法比較；

11、各組體重及尿蛋白比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，MSCs在系膜區(qū)和小管區(qū)的計數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.MSCs的特性原代接種的細(xì)胞約12小時后貼壁生長，呈大小不等的圓形。3d后出現(xiàn)細(xì)胞集落；12d左右集落間相互融合。細(xì)胞傳至第5代流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD45-，CD90+。經(jīng)成脂誘導(dǎo)12d左右，可見含有大量脂滴的脂肪細(xì)胞形成，OilRed染為紅色；成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14d后，爬片中可

12、見多個鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染為桔紅色。細(xì)胞堿性磷酸酶法胞漿染色為紅棕色。 2.動物一般情況及尿蛋白、腎功能改變制模結(jié)束時，MSC組和NS組大鼠體重增長較正常組均顯著降低，有精神萎靡、食欲減低、嗜睡等癥狀。第11周，二組體重?zé)o顯著差異；到第14周末，即輸注MSCs4周后，MSC組較NS組體重顯著增長(p<0.05)，精神、食欲好。 兩組大鼠于第9-10周開始均出現(xiàn)肉眼血尿，MSC組11周后血尿減少，14周后未再出現(xiàn)，而NS組

13、一直存在肉眼血尿。在11周末MSC組尿蛋白及腎功能與NS組比較已有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，且隨時間延長更為好轉(zhuǎn)。 3.腎臟病理改變與NS組比較，第11周末MSC組大鼠腎小球系膜增生改善無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；至第14周末，MSC組系膜增生程度顯著減輕(p<0.05)，腎小管間質(zhì)區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少；系膜區(qū)IgA熒光沉積減少。 4.細(xì)胞因子的變化ELIASA檢測顯示第11周末MSC組大鼠尿液上清中TGF-β1、

14、MCP-1含量顯著少于NS組，至第14周末與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。RT-PCR結(jié)果顯示：第11周末腎皮質(zhì)TGF-β1、MCP-1的mRNA表達(dá)MSC組較NS組顯著降低。至14周末與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。免疫組化顯示：TGF-β1、MCP-1在NS組均大量分布在腎小管間質(zhì)及腎小球系膜區(qū)；而在14周末MSC組系膜區(qū)基本無TGF-β1、MCP-1分布，小管間質(zhì)區(qū)分布亦顯著減少。 5.MSCs在腎臟中的分布MSC