靶向于血小板源性生長因子受體β的干擾素γ脂質(zhì)體對大鼠肝纖維化治療作用的研究.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病重要病理特征，是發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段。盡管迄今為止國內(nèi)外的研究就肝纖維化和早期肝硬化可以逆轉(zhuǎn)，已有共識，并在抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化并促進(jìn)其凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracel lular matrix，ECM)的合成和降解等方面取得一些成果，對肝纖維化的臨床治療提供了一些藥物和方法，但總體療效仍不理想。目前多認(rèn)為，限制臨床上應(yīng)用的抗肝纖維化藥物效果的原因，可能與藥物

2、無法達(dá)到靶細(xì)胞、或到達(dá)靶細(xì)胞但無法在其周圍形成有效的藥物濃度及半衰期短和藥物對其他組織細(xì)胞的副作用大過增加劑量帶來的療效等有關(guān)。
　　通過靶向載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物，可達(dá)到靶向、長循環(huán)進(jìn)而增加療效及減少抗肝纖維化藥物的全身副作用的目的。這里主要涉及：①靶向頭基的選擇；②載體形式的選擇；③抗肝纖維化藥物的選擇。鑒于HSC激活是肝纖維化發(fā)展過程中的中心事件，因此，HSC是抗肝纖維化治療的首選靶細(xì)胞。在HSC上，尤其是激活的HSC上特殊表達(dá)或

3、過量表達(dá)的受體，是最經(jīng)常被靶向載藥系統(tǒng)采用的靶點(diǎn)。血小板源性生長因子(platelet derired growth factor，PDGF)是肝纖維化形成過程中最強(qiáng)的促增殖因子，與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transform growth factorβ1，TGF-β1)在肝纖維化的形成中起著重要作用；而且PDGF受體β(PDGF receptorβ，PDGFR-β)已被廣泛的證明在激活的HSC上優(yōu)勢過量表達(dá)。近年來已有研究證明，環(huán)肽C*SR

4、NLIDC*(pPB)能特異性識別PDGFR-β。與其他非多肽、非脂質(zhì)體的靶向載藥系統(tǒng)相比，小分子多肽作為靶向頭基具有化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，高純度并可被大量制備的優(yōu)點(diǎn)；脂質(zhì)體作為載體具有安全、載藥譜廣的優(yōu)點(diǎn)。此外，立體穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposome，SSL)的聚乙二醇化(polyethylene glycol conjugated，PEGlated)的設(shè)計(jì)和能夠達(dá)到納米粒級別(<100nm)的粒徑，能夠

5、使它規(guī)避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，更具有長循環(huán)的特點(diǎn)。干擾素-γ(IFN-γ)是目前已經(jīng)被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的抗肝纖維化作用藥物，在許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的抗肝纖維化作用，但在臨床應(yīng)用中IFN-γ表現(xiàn)出相對低的療效、相對短的半衰期和一些嚴(yán)重的副作用，如發(fā)熱、血細(xì)胞減少、肝功能損害加重等，嚴(yán)重制約著IFN-γ的臨床應(yīng)用。
　　本研究中，我們在國內(nèi)外率先設(shè)計(jì)了針對PDGFR-β的環(huán)肽(pPB)修飾的包封工FN-γ的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體(pPB-SS

6、L-IFN-γ)，并通過體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究，從分子、細(xì)胞和器官的水平探討這個(gè)主動靶向載藥系統(tǒng)能否解決IFN-γ的療效低、半衰期短、副作用多的臨床問題，并對其作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，尋求更可能為臨床所用的抗肝纖維化的靶向藥物治療途徑，為進(jìn)一步可能的臨床研究提供理論依據(jù)，以期最終能使病人受益。
　　本研究的主要內(nèi)容包括：①環(huán)肽和靶向IFN-γ脂質(zhì)體的制備和表征；②原代大鼠肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；③環(huán)肽和靶向脂質(zhì)體對肝星狀細(xì)胞的靶

7、向性驗(yàn)證；④靶向IFN-γ脂質(zhì)體對肝星狀細(xì)胞的體外抗肝纖維化作用的研究；⑤靶向IFN-γ脂質(zhì)體在正常大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和體內(nèi)分布的研究，以及靶向IFN-γ脂質(zhì)體在肝纖維化大鼠的體內(nèi)分布和肝組織上細(xì)胞定位的研究；⑥靶向IFN-γ脂質(zhì)體對大鼠肝纖維的體內(nèi)抗肝纖維化作用和改善副作用的研究。
　　第一部分環(huán)肽和IFN-γ靶向脂質(zhì)體的制備和表征
　　目的：人工合成C*SRNLIDC*環(huán)肽(pPB)，并表征。構(gòu)建pPB介導(dǎo)的IFN-γ

8、主動靶向脂質(zhì)體(pPB-SSL-IFN-γ)，并表征其特性。
　　方法：采用固相合成的方法合成pPB，并凍干低溫保存，以高效液相分析pPB的純度，以質(zhì)譜法檢測其分子量。為制備靶向脂質(zhì)體pPB-SSL-IFN-γ，將膽固醇：蛋磷脂酰膽堿：甲氧基-聚乙二醇2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)：馬來酰亞胺-聚乙二醇3400-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mal-PEG3400-DSPE)以2:1：0.1:0.02的摩爾比

9、溶于氯仿，根據(jù)水化液不同，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化-擠壓法制備各種非靶向脂質(zhì)體。為了制備pPB介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，先將pPB與SATP反應(yīng)，給pPB引入巰基，得到pPB-SH，并質(zhì)譜驗(yàn)證其分子量，后將pPB-SH與非靶向脂質(zhì)體反應(yīng)，得各種靶向脂質(zhì)體，進(jìn)一步利用氫譜(1H-NMR)驗(yàn)證pPB-SH與非靶向脂質(zhì)體膜材料中含有的mal-PEG3400-DSPE的結(jié)合。從粒徑、包封率、載藥量、穩(wěn)定性等方面表征其理化特性。
　　結(jié)果：合成的pP

10、、pPB-FITC和pPB-SH純度>95％，質(zhì)譜檢測它們的分子量符合理論值，提示合成正確。進(jìn)一步通過對比，在mal-PEG3400-DSPE的1H-NMR上清楚顯示mal峰，在pPB-PEG3400-DSPE的1H-NMR上消失，提示了pPB與靶向脂質(zhì)體膜材料mal-PEG3400-DSPE中mal基團(tuán)通過加成反應(yīng)相連。制備的pPB-SSL-IFN-γ的平均粒徑為83.5nm，多分散指數(shù)(PI)為0.067；包封率為32.73±4.6

11、1％；載藥量為8.99x104IU/μ mol磷脂；4℃冷藏情況下，1月后無明顯變化，穩(wěn)定性良好；3月后粒徑增大、分布增寬和包封率下降，提示脂質(zhì)體顆粒有融合、粒徑變大和IFN-γ的泄漏。
　　結(jié)論：固相合成法可大量、高純度合成pPB。成功制備了下一步實(shí)驗(yàn)需要的納米級別的pPB介導(dǎo)的IFN-γ的靶向脂質(zhì)體。
　　第二部分原代大鼠肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：探討原代大鼠肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，并鑒定。為進(jìn)一

12、步的體外實(shí)驗(yàn)提供理想的細(xì)胞模型。
　　方法：采用膠原酶離體灌流、Nycodenz為分離介質(zhì)的密度梯度離心的方法分離大鼠的肝星狀細(xì)胞，并培養(yǎng)傳代及同步鑒定。
　　結(jié)果：每只大鼠肝星狀細(xì)胞的得率可達(dá)2-5x107/只，細(xì)胞存活率>90％。培養(yǎng)過程中出現(xiàn)特征性形態(tài)變化，進(jìn)一步細(xì)胞免疫熒光化學(xué)鑒定；培養(yǎng)4d，Desmin染色陽性，提示得到的為肝星狀細(xì)胞；培養(yǎng)10d和傳1代后，α-SMA染色陽性，提示為活化表型。
　　結(jié)論：成功

13、獲得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)所需的理想細(xì)胞模型‐‐‐原代大鼠活化的肝星狀細(xì)胞。
　　第三部分環(huán)肽和靶向脂質(zhì)體對肝星狀細(xì)胞的靶向性
　　目的：探討pPB環(huán)肽和pPB介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體與原代活化的大鼠肝星狀細(xì)胞和人肝星狀細(xì)胞株LX-2體外結(jié)合的特性和細(xì)胞內(nèi)定位的情況。
　　方法：合成異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的環(huán)肽(pPB-FITC)，制備包封FITC的靶向(pPB-SSL-FITC)和非靶向脂質(zhì)體(SSL-FITC)。通過流式細(xì)胞儀測

14、定pPB-FITC與原代活化的大鼠肝星狀細(xì)胞和人LX-2細(xì)胞株結(jié)合的熒光強(qiáng)度，實(shí)施結(jié)合-飽和實(shí)驗(yàn)和結(jié)合-競爭實(shí)驗(yàn)，并比較pPB-SSL-FITC和SSL-FITC與原代大鼠肝星狀細(xì)胞的結(jié)合能力。通過熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察pPB-FITC和pPB-SSL-FITC在活化的大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　結(jié)果：pPB-FITC與原代活化的大鼠肝星狀細(xì)胞和人LX-2肝星狀細(xì)胞株的結(jié)合具有飽和性和濃度依賴性；未標(biāo)記的pPB對pPB

15、-FITC與原代活化大鼠肝星狀細(xì)胞和LX-2細(xì)胞株的結(jié)合有競爭抑制作用，且呈濃度依賴性。靶向脂質(zhì)體pPB-SSL-FITC與原代大鼠活化的肝星狀細(xì)胞結(jié)合的能力是非靶向脂質(zhì)體SSL-FITC的3.01±1.50倍。原代大鼠活化的肝星狀細(xì)胞能內(nèi)吞pPB-FITC和pPB-SSL-FITC，綠色熒光信號主要分布于胞漿。
　　結(jié)論：pPB與原代大鼠肝星狀細(xì)胞和人LX-2肝星狀細(xì)胞株以受體介導(dǎo)的方式特異結(jié)合。靶向脂質(zhì)體與活化的大鼠肝星狀細(xì)胞

16、結(jié)合的能力明顯高于非靶向脂質(zhì)體，結(jié)合后靶向脂質(zhì)體被肝星狀細(xì)胞內(nèi)攝，主要分布在細(xì)胞漿，提示pPB-SSL可以作為靶向于HSC的載體來載送相關(guān)的藥物。
　　第四部分 IFN-γ靶向脂質(zhì)體對大鼠肝星狀細(xì)胞的作用
　　目的：考察pPB介導(dǎo)的IFN-γ靶向脂質(zhì)體對活化的大鼠肝星狀細(xì)胞的體外藥效及作用機(jī)制。
　　方法：通過Alamar blue分析法檢測IFN-γ脂質(zhì)體對細(xì)胞增殖的影響；通過Hoechst33258和TUNEL的方

17、法檢測IFN-γ脂質(zhì)體對細(xì)胞凋亡的影響；通過Western blot分析的方法檢測IFN-γ脂質(zhì)體對細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：含有相同IFN-γ劑量的靶向IFN-γ脂質(zhì)體與IFN-γ非靶向脂質(zhì)體和游離IFN-γ相比，明顯抑制活化的肝星狀細(xì)胞的增殖；Honchst33258和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，IFN-γ靶向脂質(zhì)體明顯抑制活化肝星狀細(xì)胞的凋亡；western blot分析法證實(shí)，IFN-γ靶向脂質(zhì)體

18、能明顯抑制活化肝星狀細(xì)胞的α-SMA的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：與游離IFN-γ和非靶向IFN-γ脂質(zhì)體相比，IFN-γ靶向脂質(zhì)體能更有效的抑制活化大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖、凋亡和α-SMA的表達(dá)。
　　第五部分 IFN-γ靶向脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)、組織分布和細(xì)胞定位
　　目的：探討IFN-γ靶向脂質(zhì)體在正常大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布的規(guī)律，并探討IFN-γ非靶向脂質(zhì)體(SSL-IFN-γ)和IFN-γ靶向脂質(zhì)體(

19、pPB-SSL-IFN-γ)在肝纖維化大鼠體內(nèi)的動態(tài)分布和肝組織上的細(xì)胞定位情況。
　　方法：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測pPB-SSL-IFN-γ和游離IFN-γ靜脈注入正常大鼠體內(nèi)5min-24h不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣本中IFN-γ的濃度，并比較兩者的半衰期(t1/2)；進(jìn)一步通過24h時(shí)獲得的大鼠的不同組織中IFN-y的濃度，觀察其組織分布情況。制備包含DIR(一種近紅外染料)的靶向和非靶向脂質(zhì)體，采用熒光活體成像儀比較

20、IFN-γ靶向脂質(zhì)體(DIR-pPB-SSL-IFN-γ)和IFN-γ非靶向脂質(zhì)體(DIR-SSL-IFN-γ)在正常大鼠和纖維化大鼠體內(nèi)分布的動態(tài)顯像的情況。采用雙重?zé)晒鈽?biāo)記免疫組化染色法，考察靶向和非靶向脂質(zhì)體攜帶的IFN-γ在纖維化大鼠肝組織內(nèi)的細(xì)胞定位情況。
　　結(jié)果：藥代動力學(xué)研究顯示：pPB介導(dǎo)的靶向IFN-γ脂質(zhì)體的半衰期(t1/2)和曲線下面積(AUC)明顯長于游離IFN-γ。組織分布研究顯示：pPB介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)

21、體運(yùn)載的IFN-γ在體內(nèi)主要聚集在肝組織內(nèi)；而游離IFN-γ在體內(nèi)主要分布在肝組織和腸；進(jìn)一步比較在同一種臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦和腸)內(nèi)的分布，pPB介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體載送的IFN-γ較游離IFN-γ明顯增多?；铙w熒光動態(tài)成像顯示：①正常大鼠體內(nèi)：DIR-SSL-IFN-γ和DIR-pPB-SSL-IFN-γ在注射后1h，肝臟區(qū)域的熒光強(qiáng)度明顯增加至最高，后強(qiáng)度逐漸下降直至48h，其它臟器才可看見熒光分布；在成像48h的時(shí)間點(diǎn)，結(jié)束

22、活體成像，取心、肝、脾、肺、腎和血液組織，立即于體外成像顯示：肝組織的熒光強(qiáng)度明顯高于其他組織，血液標(biāo)本的熒光強(qiáng)度甚至接近0，進(jìn)一步證明了活體成像中肝臟區(qū)域的熒光圖象確為肝組織中熒光顯像，并顯示了直至48h，肝組織仍明顯的熒光聚集。②纖維化大鼠體內(nèi)：DIR-pPB-SSL-IFN-γ注入纖維化大鼠體內(nèi)2h時(shí)，肝臟區(qū)域的熒光強(qiáng)度已經(jīng)明顯高于DIR-SSL-IFN-γ注入組；至20h時(shí)，這種趨勢更加明顯，甚至在DIR-SSL-IFN-γ處理

23、組的肝臟區(qū)域的熒光強(qiáng)度顯示出較2h時(shí)下降，而DIR-pPB-SSL-IFN-γ處理組大鼠肝臟區(qū)域的熒光強(qiáng)度較2h時(shí)明顯增加。雙重?zé)晒鈽?biāo)記免疫組織化學(xué)染色探測細(xì)胞定位的研究顯示：pPB-SSL攜帶的IFN-γ在肝組織中與α-SMA的共同表達(dá)率(60.13±9.15％)明顯高于SSL攜帶的IFN-γ(12.11±3.26％)(n=3，p<0.01)，且圖像顯示后者主要定位于肝細(xì)胞。
　　結(jié)論：與游離IFN-γ相比，pPB介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)

24、體攜帶的IFN-γ在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布的研究顯示了長循環(huán)的特性：IFN-γ靶向和IFN-γ非靶向脂質(zhì)體均顯示了明顯的肝組織的器官靶向特性，但I(xiàn)FN-γ靶向脂質(zhì)體在肝纖維化大鼠體內(nèi)顯示出更加明顯的肝臟器官靶向。在纖維化肝組織中靶向脂質(zhì)體攜帶的IFN-γ主要定位于肝星狀細(xì)胞；而非靶向脂質(zhì)體攜帶的IFN-γ主要定位在肝細(xì)胞，驗(yàn)證了靶向脂質(zhì)體載送的IFN-γ在纖維化大鼠肝組織內(nèi)的HSC細(xì)胞靶向性。
　　第六部分 IFN-γ靶向脂質(zhì)

25、體對大鼠肝纖維化的體內(nèi)抗肝纖維化作用和改善副作用的研究
　　目的：研究IFN-γ靶向脂質(zhì)體對大鼠肝纖維化的體內(nèi)抗肝纖維化作用，并觀察其對改善某些副作用的效果。
　　方法：將40只肝纖維化大鼠，隨機(jī)分成6組，分別給與(均尾靜脈注射，2次/周，持續(xù)4周)：①PBS(n=4)；②空白脂質(zhì)體pPB-SSL(n=4)；③IFN-γ(n=8)；④IFN-γ非靶向脂質(zhì)體(n=8)；⑤IFN-γ靶向脂質(zhì)體(n=8)；⑥5倍劑量IFN-γ組(

26、n=7)，其中①作為模型對照組(model control group)；②作為空白pPB-SSL對照組；③④⑤此3種制劑中游離IFN-γ含量均為2x105IU/ml；⑥中游離的IFN-γ含量為1×108IU/ml。6只正常大鼠在同等的條件下被飼養(yǎng)，作為正常對照組(normal control group)。最后一次靜脈注射后48h，收集大鼠的血液標(biāo)本，分別檢測肝功能(ALT、AST和ALB)、血液分析(WBC、HGB和PLT)和血清肝

27、纖維化指標(biāo)(HA和Ⅳ-C)；收集肝組織標(biāo)本，分別進(jìn)行HE、Masson膠原三色染色、羥脯氨酸含量測定、Ⅰ型膠原的免疫組織化學(xué)染色和肝組織的α-SMA蛋白表達(dá)的western blot分析。
　　結(jié)果：與模型對照組、游離IFN-γ組甚至IFN-γ非靶向脂質(zhì)體組和5倍劑量游離IFN-γ組相比，IFN-γ靶向脂質(zhì)體明顯減輕大鼠的肝纖維化分期，并明顯減少肝組織Ⅰ型膠原染色面積、血清Ⅳ-C水平和肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)；與模型對照組和游離

28、IFN-γ低劑量組相比，IFN-γ靶向脂質(zhì)體明顯改善由于肝纖維化造成的HGB和PLT的減少，還可明顯降低肝組織羥脯氨酸含量；與模型對照組相比，IFN-γ靶向脂質(zhì)體亦明顯降低肝纖維化大鼠血清ALT和HA水平；與模型對照組和游離IFN-γ高劑量組相比，IFN-γ靶向脂質(zhì)體亦明顯減輕肝纖維化大鼠的肝臟病理炎癥HAI分級。同時(shí)，IFN-γ靶向脂質(zhì)體治療組的血清AST水平較IFN-γ非靶向治療組明顯降低(P<0.05)：而且IFN-γ靶向脂質(zhì)體治