血小板源生長因子受體α在瘢痕疙瘩形成中的作用機制.pdf

1、目的：研究血小板源生長因子受體α(PDGFR-α)在瘢痕疙瘩形成中的作用及其內在機制。方法：檢測PDGFR-α在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達，并與正常皮膚成纖維細胞作對照；觀察PDGFR-α對細胞增殖和膠原合成的影響；觀察PDGFR-α激活對細胞內ERK通路激活的誘導。結果：PDGFR-α在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達顯著高于正常皮膚成纖維細胞，這種高表達顯著促進成纖維細胞增殖和膠原合成，PDGFR-α激活后主要通過細胞內E

2、RK通路來傳遞促細胞增殖和膠原合成的信號。結論：PDGFR-α高表達對促進瘢痕疙瘩形成有重要意義。 一、研究背景瘢痕疙瘩是人類特有的一種病理現象，其造成的外形破壞和功能障礙是目前整形外科治療中急待解決的難題。其形成機制復雜，雖然國內外學者已從多方面對瘢痕疙瘩進行了廣泛的研究，但其病因機制仍不清楚。現已確定瘢痕疙瘩是以成纖維細胞旺盛增殖和以膠原為主的細胞外基質過度合成、沉積為特征的纖維化疾病，而且發(fā)現多種促纖維化細胞因子在瘢痕疙瘩

3、的形成中起重要作用。血小板源生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)是體內一種主要促有絲分裂劑，可以刺激成纖維細胞、平滑肌細胞等多種組織細胞增殖、趨化及遷移，與肺纖維化、腎小球腎炎、硬皮病等多種纖維化疾病都密切相關。PDGF是由多種異構體組成的家族，通過特異性結合并激活靶細胞膜上的血小板源生長因子受體(platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)而發(fā)揮作用，

4、PDGFR是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可分為α、β兩種亞基，PDGFR-α和PDGFR-β結構相似，但在不同種類細胞中的表達卻存在很多差異性，在細胞中的表達水平也不恒定，在體內介導的功能之間的差異性更為明顯。已有報道瘢痕疙瘩成纖維細胞對PDGF促細胞增殖和膠原合成的反應性都高于正常，這種高反應性可能是由瘢痕疙瘩成纖維細胞受體水平升高所介導，但具體機制不明，不同研究對于瘢痕疙瘩成纖維細胞中是否存在PDGFR表達增高、何種受體

5、表達增高等都存在分歧。 近年來，隨著現代細胞生物學和分子生物學的發(fā)展，病理性瘢痕增生與細胞信號轉導關系的研究也逐漸受到人們重視。細胞信號轉導是指細胞外的刺激信號通過細胞膜和細胞內的一系列信號分子和生化級聯反應傳導到細胞內的靶分子，進而發(fā)生細胞增殖、分化、凋亡、粘附及物質合成等生物學效應的一系列生物活性反應過程。生命過程就是以細胞信號轉導為基礎的生物化學反應過程，創(chuàng)傷后病理性瘢痕增生是由于參與修復的細胞增殖大于凋亡、細胞外基質合成

6、大于降解而形成的，這必然涉及細胞對各種刺激的反應－細胞信號轉導過程?，F已開展關于惡性腫瘤、動脈粥樣硬化等許多疾病發(fā)生過程中PDGF及其受體家族信號轉導方面的研究，但對于瘢痕疙瘩形成過程中PDGF及其受體家族信號轉導方面的研究卻還是空白。 二、研究目的 (1)檢測PDGFR-α、PDGFR-β在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中蛋白及mRNA水平的表達。 (2)檢測PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纖維細胞中

7、表達升高對成纖維細胞增殖及膠原合成的影響。 (3)檢測PDGFR-α磷酸化對成纖維細胞內ERK通路的激活情況以及ERK通路激活對成纖維細胞增殖及膠原合成的影響。 (4)了解PDGFR-α在瘢痕疙瘩形成中的作用機制，為探索新的防治方法提供思路。 三、研究內容和方法(1).切取瘢痕疙瘩標本和包皮正常皮膚標本進行成纖維細胞原代培養(yǎng)，將第3代細胞用于實驗，分別采用免疫細胞化學、實時定量PCR和westernblot方法檢

8、測了PDGFR-α、PDGFR-β在蛋白質及mRNA水平的各自表達。 (2)應用不同濃度的PDGFR-α刺激劑PDGF-AB對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞進行干預處理，并分別通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測兩組成纖維細胞增殖和膠原合成。 (3)應用不同濃度的PDGFR-α抑制劑AG1296對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞進行干預處理，并分別通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測兩組成纖維細

9、胞增殖和膠原合成。 (4)采用westernblot方法分別檢測PDGF-AB刺激后瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中PDGFR-α及ERK通路關鍵酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平。 (5)應用不同濃度的選擇性ERK磷酸化抑制劑PD98059對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞進行干預處理，通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測細胞增殖和膠原合成。 四、研究結果 (1)免疫細胞

10、化學染色顯示瘢痕疙瘩成纖維細胞中的PDGFR-α和PDGFR-β的染色較正常皮膚成纖維細胞增強，PDGFR-α的染色增強尤其明顯。圖像定量分析顯示瘢痕疙瘩成纖維細胞中PDGFR-α表達的陽性指數顯著大于正常皮膚成纖維細胞，而瘢痕疙瘩成纖維細胞中PDGFR-β表達的陽性指數與正常皮膚組成纖維細胞比無顯著性差異。通過比較westernblot的積分光密度值，顯示PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纖維細胞中蛋白表達顯著高于正常皮膚成纖維細胞，而PDG

11、FR-β在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的蛋白表達與正常皮膚成纖維細胞相比未見顯著升高。通過比較實時定量PCR每百萬看家基因含量，顯示與正常皮膚組成纖維細胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細胞中PDGFR-α的mRNA表達顯著升高，而PDGFR-β的mRNA表達升高不顯著。 (2)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示在無PDGF-AB干預條件下，瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和膠原合成都顯著高于正常皮膚成纖維細胞。PDGF-AB以劑量依賴方式增加兩組成纖

12、維細胞的細胞增殖和膠原合成，PDGF-AB對瘢痕疙瘩成纖維細胞的飽和濃度明顯高于正常皮膚成纖維細胞，兩組成纖維細胞增殖和膠原合成差異隨著PDGF-AB濃度的增加而擴大。 (3)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示在無AG1296干預條件下，瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和膠原合成都顯著高于正常皮膚成纖維細胞。AG1296以劑量依賴方式減少兩組成纖維細胞的細胞增殖和膠原合成，但AG1296對瘢痕疙瘩成纖維細胞的飽和濃度明顯高于正常皮膚

13、成纖維細胞，經一定濃度AG1296作用后可以消除兩組成纖維細胞增殖和膠原合成之間的差異。 (4)通過westernblot檢測，顯示PDGF-AB刺激以劑量依賴方式升高PDGFR-α及ERK通路3個關鍵酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平，而且在同等濃度PDGF-AB刺激下瘢痕疙瘩成纖維細胞中PDGFR-α及上述酶的磷酸化水平顯著高于正常皮膚成纖維細胞。 (5)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示PD9805

14、9以劑量依賴方式抑制PDGF-AB誘導的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞增殖，但PD98059對瘢痕疙瘩成纖維細胞的飽和濃度高于正常皮膚成纖維細胞。PD98059以非劑量依賴方式抑制PDGF-AB誘導的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞膠原合成。 五、研究結論瘢痕疙瘩成纖維細胞中PDGFR-α的mRNA和蛋白表達水平都顯著高于正常皮膚成纖維細胞，而兩組成纖維細胞中PDGFR-β的表達則無顯著性差異。瘢痕疙瘩成纖維細胞中