血小板源性生長因子受體-β在小鼠腦出血后腦損傷中的作用機制研究.pdf

1、第一部分小鼠腦出血后腦組織中血小板源性生長因子受體-β及其配體血小板源性生長因子-BB的表達變化
　　目的：應用小鼠腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）模型，探討小鼠腦出血后不同時間點血小板源性生長因子受體-β（Platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β）及其配體血小板源性生長因子-BB（Platelet-derived growth facto

2、r-BB，PDGF-BB）的表達變化情況。
　　方法：將42只8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機分為六組：對照組和5個時間點組（ICH后3h組、ICH后6h組、ICH后12h組、ICH后24h組、ICH后72h組），每組7只CD1小鼠（n=7）。應用自體動脈血誘導的腦出血模型（blood ICH，bICH），通過western blot的方法，檢測PDGFR-β和PDGF-BB的表達變化情況，通過免疫熒光染色的方法測定小鼠

3、腦出血后PDGFR-β的表達水平和細胞定位情況。
　　結果：Western blot的結果提示小鼠腦出血24小時后同側大腦半球PDGF-BB的表達水平顯著高于對側大腦半球(p<0.05)；PDGFR-β的表達從小鼠腦出血后6小時開始升高(p<0.05)，并且直到腦出血后24小時都維持在升高的水平(p<0.05)。免疫熒光染色結果提示在小鼠腦出血后24小時的血腫周圍，可以檢測到PDGFR-β與血管平滑肌細胞（vascular smo

4、oth muscle cell，VSMC）標記蛋白（α-平滑肌肌動蛋白，α-smooth muscle actin，α-SMA）的共表達。
　　結論：小鼠腦出血后PDGFR-β和PDGF-BB的表達增多，并且在血腫周圍的血管平滑肌細胞中檢測到PDGFR-β的表達。提示PDGFR-β可能參與小鼠腦出血后的腦損傷（brain injury）的過程以及血管平滑肌細胞（VSMC）表型轉換（phenotypic transformation

5、）過程。
　　第二部分抑制血小板源性生長因子受體-β改善小鼠腦出血后的腦損傷
　　目的：應用小鼠自體動脈血誘導的腦出血模型，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術和PDGFR-β抑制劑（Gleevec）抑制PDGFR-β表達，探討抑制PDGFR-β是否能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　方法：將108只8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機分為對照組（n=24），ICH組

6、（n=26），ICH+ scramble siRNA組（n=26），ICH+ PDGFR-β siRNA組（n=26），ICH+Gleevec組（n=6）。應用小鼠自體動脈血誘導的腦出血模型，在ICH前24小時腦室注射scramble siRNA和PDGFR-β siRNA，在ICH后1小時腹腔注射PDGFR-β抑制劑（Gleevec）。ICH24和48小時后測定小鼠神經行為學評分情況；ICH24和48小時后處死小鼠，取同側及對側大腦半

7、球做標本，測定腦水腫變化情況；ICH24小時后處死小鼠，取腦組織做標本，通過western blot方法和免疫熒光染色的方法測定炎癥反應情況和腦血管平滑肌細胞表型轉換情況。探討抑制PDGFR-β是否能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　結果：與對照組相比，小鼠ICH后24小時和48小時神經行為學評分明顯降低(p<0.05)，而ICH+ PDGFR-β siRNA組相對ICH組行為學評分明顯提高(p<0.05)，ICH+ scra

8、mble siRNA組則無明顯變化。與對照組相比，ICH后24小時和48小時后小鼠同側基底節(jié)腦水腫明顯增加(p<0.05)，而ICH+PDGFR-β siRNA組相對ICH組腦水腫顯著降低(p<0.05)，ICH+ scramble siRNA組則無明顯變化。小鼠ICH后24小時，同側大腦半球非平滑肌肌球蛋白2B（smooth non-muscle myosin IIB，SMemb）、細胞間粘附分子-1（Intercellular ad

9、hesion molecule-1，ICAM-1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）表達明顯增加(p<0.05)，而ICH+ PDGFR-β siRNA組相對于ICH組明顯降低(p<0.05)，ICH+ scramble siRNA組則無明顯變化。另外，ICH+Gleevec組小鼠腦組織的 SMemb、ICAM-1表達相對于 ICH組也顯著降低(p<0.05)。免疫熒光染色結果表明，在小鼠腦出血后24小時的血腫周圍

10、，可以檢測到SMemb和ICAM-1與血管平滑肌細胞標記蛋白（α-SMA）的共表達，并且，ICH組和ICH+ scramble siRNA組MPO陽性細胞較對照組增多(p<0.05)，ICH+ PDGFR-β siRNA組MPO陽性細胞則較ICH組和ICH+ scramble siRNA組減少。
　　結論：抑制PDGFR-β能夠降低ICH引起的小鼠神經行為學評分降低和腦水腫增加，并且能夠減輕ICH后的炎癥反應和血管平滑肌細胞表型轉

11、換過程。提示抑制PDGFR-β能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　第三部分血小板源性生長因子受體-β調控腦出血后腦血管平滑肌細胞表型轉換及炎癥反應的分子機制
　　目的：應用小鼠自體動脈血誘導的腦出血模型，通過siRNA技術和PDGFR-β抑制劑（Gleevec）抑制PDGFR-β表達，通過重組PDGF-BB和絲裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase-activa

12、ted protein kinase2，MAPKAPK2，MK2）抑制劑（KKKALNRQLGVAA）等干預，檢測信號通路相關分子的表達情況，探討PDGFR-β是否通過p38-MK2信號通路引起血管平滑肌細胞表型轉換和加重炎癥反應。
　　方法：對照組（n=7），ICH組（n=7），ICH+scramble siRNA組（n=7），ICH+PDGFR-β siRNA組（n=7）小鼠利用第二部分實驗所產生的標本用于分子檢測。另將12只

13、8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機分為PDGF-BB組（n=6），PDGF-BB+ MK2抑制劑組（n=6）。應用小鼠使用立體定向儀向小鼠右側基底節(jié)區(qū)注射重組PDGF-BB（200 ng/2ul PBS）和MK2抑制劑KKKALNRQLGVAA(2ug/kg)，通過western blot方法和免疫熒光染色的方法檢測信號通路相關分子的表達情況，探討PDGFR-β是否通過p38-MK2信號通路引起血管平滑肌細胞表型轉換和加重炎癥反

14、應。
　　結果：Western blot檢測結果表明，小鼠腦出血后24小時與對照組相比，血腫同側大腦半球的 p-PDGFR-β、p-P38和 p-MK2的表達明顯增高（P<0.05），ICH+scramble siRNA組的p- PDGFR-β、p-P38和p-MK2的表達相比較于對照組也有明顯增高（P<0.05），ICH+ PDGFR-β siRNA組則相對于ICH組和ICH+ scramble siRNA組明顯降低（P<0.0

15、5）。PDGF-BB組小鼠與對照組相比，ICAM-1表達明顯增高（P<0.05），PDGF-BB+ MK2抑制劑組小鼠與PDGF-BB組相比，ICAM-1表達明顯降低（P<0.05）。免疫熒光染色結果表明，在小鼠腦出血后24小時的血腫周圍，可以檢測到p-p38和p-MK2與血管平滑肌細胞標記蛋白（α-SMA）的共表達。
　　結論：小鼠ICH后，PDGFR-β通過與PDGF-BB結合，激活p38-MK2信號通路引起血管平滑肌細胞表型