血小板源性生長因子受體-β在小鼠腦出血后腦損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分小鼠腦出血后腦組織中血小板源性生長因子受體-β及其配體血小板源性生長因子-BB的表達(dá)變化
　　目的：應(yīng)用小鼠腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）模型，探討小鼠腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)血小板源性生長因子受體-β（Platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β）及其配體血小板源性生長因子-BB（Platelet-derived growth facto

2、r-BB，PDGF-BB）的表達(dá)變化情況。
　　方法：將42只8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機(jī)分為六組：對(duì)照組和5個(gè)時(shí)間點(diǎn)組（ICH后3h組、ICH后6h組、ICH后12h組、ICH后24h組、ICH后72h組），每組7只CD1小鼠（n=7）。應(yīng)用自體動(dòng)脈血誘導(dǎo)的腦出血模型（blood ICH，bICH），通過western blot的方法，檢測PDGFR-β和PDGF-BB的表達(dá)變化情況，通過免疫熒光染色的方法測定小鼠

3、腦出血后PDGFR-β的表達(dá)水平和細(xì)胞定位情況。
　　結(jié)果：Western blot的結(jié)果提示小鼠腦出血24小時(shí)后同側(cè)大腦半球PDGF-BB的表達(dá)水平顯著高于對(duì)側(cè)大腦半球(p<0.05)；PDGFR-β的表達(dá)從小鼠腦出血后6小時(shí)開始升高(p<0.05)，并且直到腦出血后24小時(shí)都維持在升高的水平(p<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果提示在小鼠腦出血后24小時(shí)的血腫周圍，可以檢測到PDGFR-β與血管平滑肌細(xì)胞（vascular smo

4、oth muscle cell，VSMC）標(biāo)記蛋白（α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，α-smooth muscle actin，α-SMA）的共表達(dá)。
　　結(jié)論：小鼠腦出血后PDGFR-β和PDGF-BB的表達(dá)增多，并且在血腫周圍的血管平滑肌細(xì)胞中檢測到PDGFR-β的表達(dá)。提示PDGFR-β可能參與小鼠腦出血后的腦損傷（brain injury）的過程以及血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）表型轉(zhuǎn)換（phenotypic transformation

5、）過程。
　　第二部分抑制血小板源性生長因子受體-β改善小鼠腦出血后的腦損傷
　　目的：應(yīng)用小鼠自體動(dòng)脈血誘導(dǎo)的腦出血模型，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)和PDGFR-β抑制劑（Gleevec）抑制PDGFR-β表達(dá)，探討抑制PDGFR-β是否能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　方法：將108只8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=24），ICH組

6、（n=26），ICH+ scramble siRNA組（n=26），ICH+ PDGFR-β siRNA組（n=26），ICH+Gleevec組（n=6）。應(yīng)用小鼠自體動(dòng)脈血誘導(dǎo)的腦出血模型，在ICH前24小時(shí)腦室注射scramble siRNA和PDGFR-β siRNA，在ICH后1小時(shí)腹腔注射PDGFR-β抑制劑（Gleevec）。ICH24和48小時(shí)后測定小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分情況；ICH24和48小時(shí)后處死小鼠，取同側(cè)及對(duì)側(cè)大腦半

7、球做標(biāo)本，測定腦水腫變化情況；ICH24小時(shí)后處死小鼠，取腦組織做標(biāo)本，通過western blot方法和免疫熒光染色的方法測定炎癥反應(yīng)情況和腦血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換情況。探討抑制PDGFR-β是否能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，小鼠ICH后24小時(shí)和48小時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(p<0.05)，而ICH+ PDGFR-β siRNA組相對(duì)ICH組行為學(xué)評(píng)分明顯提高(p<0.05)，ICH+ scra

8、mble siRNA組則無明顯變化。與對(duì)照組相比，ICH后24小時(shí)和48小時(shí)后小鼠同側(cè)基底節(jié)腦水腫明顯增加(p<0.05)，而ICH+PDGFR-β siRNA組相對(duì)ICH組腦水腫顯著降低(p<0.05)，ICH+ scramble siRNA組則無明顯變化。小鼠ICH后24小時(shí)，同側(cè)大腦半球非平滑肌肌球蛋白2B（smooth non-muscle myosin IIB，SMemb）、細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular ad

9、hesion molecule-1，ICAM-1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）表達(dá)明顯增加(p<0.05)，而ICH+ PDGFR-β siRNA組相對(duì)于ICH組明顯降低(p<0.05)，ICH+ scramble siRNA組則無明顯變化。另外，ICH+Gleevec組小鼠腦組織的 SMemb、ICAM-1表達(dá)相對(duì)于 ICH組也顯著降低(p<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果表明，在小鼠腦出血后24小時(shí)的血腫周圍

10、，可以檢測到SMemb和ICAM-1與血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白（α-SMA）的共表達(dá)，并且，ICH組和ICH+ scramble siRNA組MPO陽性細(xì)胞較對(duì)照組增多(p<0.05)，ICH+ PDGFR-β siRNA組MPO陽性細(xì)胞則較ICH組和ICH+ scramble siRNA組減少。
　　結(jié)論：抑制PDGFR-β能夠降低ICH引起的小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低和腦水腫增加，并且能夠減輕ICH后的炎癥反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)

11、換過程。提示抑制PDGFR-β能夠改善小鼠腦出血后的腦損傷情況。
　　第三部分血小板源性生長因子受體-β調(diào)控腦出血后腦血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換及炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制
　　目的：應(yīng)用小鼠自體動(dòng)脈血誘導(dǎo)的腦出血模型，通過siRNA技術(shù)和PDGFR-β抑制劑（Gleevec）抑制PDGFR-β表達(dá)，通過重組PDGF-BB和絲裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase-activa

12、ted protein kinase2，MAPKAPK2，MK2）抑制劑（KKKALNRQLGVAA）等干預(yù)，檢測信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，探討PDGFR-β是否通過p38-MK2信號(hào)通路引起血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和加重炎癥反應(yīng)。
　　方法：對(duì)照組（n=7），ICH組（n=7），ICH+scramble siRNA組（n=7），ICH+PDGFR-β siRNA組（n=7）小鼠利用第二部分實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的標(biāo)本用于分子檢測。另將12只

13、8周大小、重量約30克的雄性CD1小鼠隨機(jī)分為PDGF-BB組（n=6），PDGF-BB+ MK2抑制劑組（n=6）。應(yīng)用小鼠使用立體定向儀向小鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)注射重組PDGF-BB（200 ng/2ul PBS）和MK2抑制劑KKKALNRQLGVAA(2ug/kg)，通過western blot方法和免疫熒光染色的方法檢測信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，探討PDGFR-β是否通過p38-MK2信號(hào)通路引起血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和加重炎癥反

14、應(yīng)。
　　結(jié)果：Western blot檢測結(jié)果表明，小鼠腦出血后24小時(shí)與對(duì)照組相比，血腫同側(cè)大腦半球的 p-PDGFR-β、p-P38和 p-MK2的表達(dá)明顯增高（P<0.05），ICH+scramble siRNA組的p- PDGFR-β、p-P38和p-MK2的表達(dá)相比較于對(duì)照組也有明顯增高（P<0.05），ICH+ PDGFR-β siRNA組則相對(duì)于ICH組和ICH+ scramble siRNA組明顯降低（P<0.0

15、5）。PDGF-BB組小鼠與對(duì)照組相比，ICAM-1表達(dá)明顯增高（P<0.05），PDGF-BB+ MK2抑制劑組小鼠與PDGF-BB組相比，ICAM-1表達(dá)明顯降低（P<0.05）。免疫熒光染色結(jié)果表明，在小鼠腦出血后24小時(shí)的血腫周圍，可以檢測到p-p38和p-MK2與血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白（α-SMA）的共表達(dá)。
　　結(jié)論：小鼠ICH后，PDGFR-β通過與PDGF-BB結(jié)合，激活p38-MK2信號(hào)通路引起血管平滑肌細(xì)胞表型