血小板源性生長因子在煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分:
　　 煙霧暴露大鼠肺血管小板源性生長因子的表達及其與肺血管重塑的關(guān)系
　　 目的:
　　 觀察煙霧暴露大鼠肺動脈形態(tài)學(xué)變化、壓力變化及血小板源性生長因子(PDGFB/PDGFR-β)表達變化，探討煙霧暴露致大鼠肺血管重塑中PDGFB/PDGFR-β的表達變化及其意義。
　　 方法:
　　 40只雄性SD大鼠隨機分為對照組(C組)、煙霧暴露1月組(S1m)、煙霧暴露2月組(S2m)、煙霧

2、暴露3月組(S3m)，建立煙霧暴露大鼠模型，檢測各組大鼠動脈血氧分壓(PaO2)、平均右心室收縮壓(mRVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，HE染色觀察肺動脈組織學(xué)改變并測量肺小動脈管壁面積/管總面積(WA％)，Masson染色檢測肺動脈壁膠原增殖，透射電鏡觀察肺小動脈的超微結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色法觀察肺動脈平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western-blotting檢測肺動脈PDGFB[P

3、DGFR-βmRNA及蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.C組、S1m、S2m及S3m組PaO2值分別為（96.2±4.3）、（92.1±5.2）、(90.5±4.1)及(89.6±4.8)mmHg，各組問比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 2.S3m組mRVSP及RVHI值為(65.63±5.6,54.79±7.13)與C組(14.07±4.18,32.41±0.26)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

4、P＜0.01)；S1m組(16.85±1.26,36.62±1.32)、S2m組(23.57±4.51,40.23±2.12)與C組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　 3.C組、S1m、S2m及S3m組WA％值分別為(31.29±1.95)％、(42.68±2.24)％、(51.84±2.38)％、(62.11±1.39)％，隨煙霧暴露時間延長，WA％呈時間依賴性增加，與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0

5、1）；煙霧暴露各組問比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 4.C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈管壁膠原厚度分別為(4.67±0.36)μm、(8.96±1.80)μm、(11.8±2.12)μm、(15.3±1.65)μm。隨煙霧暴露時間延長，肺動脈管壁膠原沉積呈時間依賴性增加，與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；煙霧暴露各組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 5.肺小動

6、脈超微結(jié)構(gòu)觀察：C組內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，胞外未見膠原纖維增生，平滑肌細胞未見增生。S1m組肺小動脈內(nèi)皮細胞形狀不規(guī)則，內(nèi)膜增厚，細胞內(nèi)可見線粒體腫脹，平滑肌細胞輕度增生。S2m組內(nèi)彈力膜厚薄不均，平滑肌走向不規(guī)則，膠原纖維增生。S3m組肺小動脈結(jié)構(gòu)層次紊亂，內(nèi)皮細胞變形嚴(yán)重，膠原纖維大量增生。
　　 6.C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈α-SMA表達量分別為（37.5±7.5）、(52.6±14.3)、(72.2±13.6)、

7、(98.1±15.6)，隨煙霧暴露時間延長，肺動脈α-SMA表達量呈時間依賴性增加，與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；煙霧暴露各組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 7.肺動脈PDGFB/PDGFR-βmRNA和蛋白表達的比較
　　 (1)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFBmRNA表達量分別為(0.31±0.09)、(0.35±0.02)、(0.42±0.01)、(0.55±

8、0.03)，隨煙霧暴露時間延長，肺動脈PDGFBmRNA表達量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 (2)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFB蛋白表達量分別為(1.38±0.04)、(1.50±0.02)、(1.58±0.06)、(1.44±0.02)；隨煙霧暴露時間延長，PDGFB蛋白表達量增加。煙霧暴露各組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 (

9、3)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFR-βmRNA表達量分別為(0.21±0.09)、(0.41±0.02)、(0.61±0.03)、（0.83±0.08）；隨煙霧暴露時間延長，PDGFR-βmRNA表達量逐漸增加。煙霧暴露各組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 (4)C組、S1m、S2m及S3m組肺動脈PDGFR-β蛋白表達量分別為（1.23±0.01）、(1.50±0.01)、(1.38±0

10、.02)、(1.57±0.04)；隨煙霧暴露時間延長，PDGFR-β蛋白表達量增加。煙霧暴露各組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 8.相關(guān)性分析mRVSP與RVHI成正相關(guān)(r=0.713，P＜0.05)；PDGFBmRNA及蛋白表達量與WA％均呈正相關(guān)(分別為r=0.941，r=0.605，均P＜0.05)；PDGFR-βmRNA及蛋白表達量與WA％均呈正相關(guān)(分別為r=0.936，r=0.820，均P

11、＜0.05)；PDGFB與PDGFR-βmRNA表達量呈正相關(guān)(r=0.921，P＜0.05)；PDGFB與PDGFR-β蛋白表達無相關(guān)性(r=0.379，P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.煙霧暴露可使肺血管形態(tài)發(fā)生明顯改變，肺小動脈超微結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致肺血管重塑，肺血流阻力增加，右心室收縮壓升高。
　　 2.煙霧暴露上調(diào)大鼠肺動脈PDGFB/PDGFR-β表達，PDGFB/PDGFR-β在肺血管重塑、肺動

12、脈高壓形成過程中起重要作用。
　　 第二部分:
　　 血小板源性生長因子在香煙煙霧提取物介導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增殖中的表達變化
　　 目的:
　　 探討香煙煙霧提取物(CSE)對大鼠肺動脈平滑肌細胞(rPASMCs)增殖的影響及血小板源性生長因子(PDGFB/PDGFR-β)在其中的作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)rPASMCs，不同濃度CSE(0，2.5％,5％，10％，20％)作用

13、于rPASMCs24小時，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測rPASMCs增殖，流式細胞術(shù)觀察細胞周期變化。
　　 2.不同濃度CSE(0，2.5％,5％，10％，20％)作用于rPASMCs24小時，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western-blotting分別檢測PDGFB/PDGFR-βmRNA和蛋白表達。
　　 3.rPASMCs與不同濃度PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)(1μM/L，2μM

14、/L,4μM/L，8μM/L)預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，MTT法觀察細胞增殖的變化。
　　 4.rPASMCs與PDGFR阻斷劑伊馬替尼(Imatinib)8μM預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，Western-blotting檢測PDGFB/PDGFR-β蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.CSE各組(2.5％,5％，10％，20％)rPASMCsMTT吸光度(A)值分別為(1.

15、839±0.128)、(2.241±0.182)、(2.951±0.072)、(4.329±0.176)，與對照組(0.977±0.156)比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。CSE各組(2.5％,5％，10％，20％)rPASMCsS期細胞百分?jǐn)?shù)分別為（17.08±0.31）、（18.47±0.21）、(23.19±0.16)、(23.71±0.29)，與對照組(13.04±2.39)比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

16、均P＜0.01）。CSE各組(2.5％,5％，10％，20％)rPASMCsG2期細胞百分?jǐn)?shù)分別為(45.21±5.20)、(47.05±14.14)、(42.05±8.97)、(41.15±6.80)，與對照組(22.77±3.04)比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 2.CSE各組(2.5％,5％，10％，20％)PDGFBmRNA表達量分別為(0.647±0.035)、(0.819±0.065)、(

17、0.776±0.046)，(0.623±0.048)，與對照組(0.411±0.026)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)；CSE各組PDGFR-βmRNA表達量分別為(0.393±0.021)、(0.739±0.034)、(0.745±0.032)、(0.620±0.019)，與對照組(0.411±0.011)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)；CSE各組(2.5％,5％，10％，20％)PDGFB蛋白表達量分別為(0

18、.367±0.015)、(0.716±0.033)、(0.897±0.041)、(1.202±0.039)，與對照組(0.544±0.025)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)；PDGFR-β蛋白表達量分別為(0.718±0.019)、(0.920±0.039)、(0.998±0.081)、(1.061±0.057)，與對照組(0.585±0.026)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 3.10％CSE組

19、MTT(A)值(2.643±0.099)增高，與對照組(0.856±0.017)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；10％CSE+lmatinib各組(1μM/L，2μM/L,4μM/L，8μM/L)(A)值均降低，分別為(2.012±0.391)、(1.997±0.379)、(1.458±0.495)、(1.022±0.102)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.10％CSE處理后，rP

20、ASMCs中PDGFB蛋白表達量升高(1.662±0.271)，與對照組(0.996±0.181)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；伊馬替尼(Imatinib)干預(yù)后PDGFB蛋白表達量降低(1.231±0.192)，與10％CSE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；10％CSE處理后，rPASMCs中PDGFR-β蛋白表達量升高(1.581±0.153)，與對照組(0.986±0.131)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0

21、5）；伊馬替尼(Imatinib)干預(yù)后PDGFR-β蛋白表達量降低(1.211±0.192)，與10％CSE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.CSE可誘導(dǎo)rPASMCs增殖。
　　 2.CSE可使rPASMCs周期發(fā)生變化，細胞由G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)換，促進細胞DNA復(fù)制和有絲分裂。
　　 3.CSE誘導(dǎo)PDGFB/PDGFR-βmRNA和蛋白表達上調(diào)。
　　

22、 4.CSE誘導(dǎo)PDGFB及PDGFR-β表達上調(diào)，二者存在相關(guān)關(guān)系?？赡芘cPDGF信號通路配體PDGFB與受體PDGFR-β相互作用有關(guān)。
　　 5.PDGFR阻斷劑可抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs增殖效應(yīng)且對PDGFB/PDGFR-β表達上調(diào)有明顯的抑制效應(yīng)，其機制有待進一步研究。
　　 第三部分:
　　 蛋白激酶C-6途徑促進大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的機制研究
　　 目的:
　　 探討蛋白激

23、酶C-δ(PKC-δ)在香煙煙霧提取物(CSE)對大鼠肺動脈平滑肌細胞(rPASMCs)增殖中的影響及其對PDGFB/PDGFR-β表達的作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)rPASMCs細胞，rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，MTT法觀察細胞增殖的變化。
　　 2.rPASMCs與Rottl

24、erin8nM/L預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，流式細胞術(shù)觀察細胞周期的變化。
　　 3.rPASMCs與不同濃度的PKC-δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測PKC-δmRNA和蛋白及pi-PKC-δ蛋白的表達。
　　 4.rPASMCs與不同濃度的PKC-

25、δ阻斷劑Rottlerin(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)預(yù)孵育1小時，然后暴露于10％CSE24小時，采用RT-PCR、Western-blotting方法分別檢測PDGFB/PDGFR-βmRNA和蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.10％CSE組rPASMCs的MTT(A)值(3.535±0.353)增高，與對照組(0.873±0.184)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。10％CSE+R

26、ottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)A值均降低，分別為(2.322±0.358)、(2.227±0.291)、(1.903±0.212)、(0.944±0.109)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 2.10％CSE組rPASMCs的S期細胞百分?jǐn)?shù)(22.39±1.09)增高，與對照組(6.51±1.23)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。10％CSE+R

27、ottlerin8nM/L組S期細胞百分?jǐn)?shù)降低為(12.21±1.96)，與10％CSE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。10％CSE組rPASMCs的G2期細胞百分?jǐn)?shù)(17.12±0.45)增高，與對照組(4.03±2.96)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。10％CSE+Rottlerin8nM/L組G2期細胞百分?jǐn)?shù)降低為(8.59±2.05)，與10％CSE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3

28、.各組PKC-δmRNA和蛋白表達變化
　　 (1)各組PKC-δmRNA和蛋白表達量：對照組為(0.955±0.049，0.758±0.131)，10％CSE組為（1.068±0.079，0.873±0.011），10％CSE+Rottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)分別為(1.027±0.113，0.813±0.174)、(0.971±0.118，0.723±0.117)、(0.851±0.0

29、65，0.904±0.011)、(0.887±0.053，0.881±0.025)，各組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (2)各組pi-PKC-δ蛋白表達量：10％CSE組（1.485±0.058）增高，與對照組(0.985±0.009)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10％CSE+Rottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)pi-PKC-δ蛋白表達量下降，分別為(1.257

30、±0.050)、(1.146±0.174)、(1.051±0.019)、(1.006±0.018)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 4.Rottlerin阻斷后各組PDGFB/PDGFR-β表達
　　 (1)各組PDGFBmRNA表達：10％CSE組(1.245±0.020)增高，與對照組(0.649±0.046)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10％CSE+Rottlerin

31、各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)PDGFBmRNA表達降低，分別為(1.235±0.086)、(0.722±0.035)、(0.679±0.023)、(0.676±0.035)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 (2)各組PDGFB蛋白表達：10％CSE組(1.746±0.132)增高，與對照組(0.654±0.009)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。10％CSE+

32、Rottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)PDGFB蛋白表達降低，分別為(1.322±0.066)、(0.913±0.020)、(0.932±0.219)、(0.918±0.013)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 (3)各組PDGFR-βmRNA表達：10％CSE組(1.728±0.029)增高，與對照組(0.973±0.069)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.

33、05）。10％CSE+Rottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)PDGFR-βmRNA表達降低，分別為(1.225±0.056)、(1.021±0.074)、(0.935±0.051)、(0.745±0.074)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 (4)各組PDGFR-β蛋白表達：10％CSE組(1.207±0.058)增高，與對照組(0.657±0.009)比較，

34、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10％CSE+Rottlerin各組(1nM/L，2nM/L,4nM/L，8nM/L)PDGFR-β蛋白表達降低，分別為(1.176±0.050)、(0.848±0.174)、(0.843±0.019)、(0.838±0.018)，與10％CSE組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CSE對PKC-δ的mRNA和蛋白表達無明顯作用。
　　 2.C

35、SE上調(diào)磷酸化PKC-δ蛋白表達，PKC-δ阻斷劑Rottlerin對磷酸化PKC-δ蛋白表達上調(diào)有明顯的抑制作用。
　　 3.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs細胞增殖效應(yīng)。
　　 4.PKC-δ阻斷劑Rottlerin可以抑制CSE誘導(dǎo)的rPASMCs細胞周期變化。
　　 5.PKC-δ阻斷劑Rottlerin對CSE誘導(dǎo)的PDGFB和PDGFR-β表達上調(diào)有明顯的抑制作用，