人偏肺病毒分離、融合蛋白表達(dá)及主要蛋白的免疫信息學(xué)分析.pdf

1、目的：分離新近發(fā)現(xiàn)的兒童呼吸道病毒病原一一人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus，hMPV)中國(guó)大陸流行株，并初步闡明其分子流行病學(xué)規(guī)律。 方法：選取重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院因呼吸道感染住院的患兒，無菌采集鼻咽分泌物兩份。一份用直接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A／B、副流感病毒1、2、3型等常見呼吸道病毒病原。另一份標(biāo)本接種Vero-E6細(xì)胞和LLC-MK2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，用含胰酶的病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基維

2、持培養(yǎng)至21天，觀察細(xì)胞病變(CPE)。出現(xiàn)CPE者，采用RT-PCR擴(kuò)增hMPVN、F基因，F(xiàn)基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序。用Phylip軟件包中的鄰接法與最大節(jié)約法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，用ClustalX軟件進(jìn)行F基因序列比對(duì)分析。收集分析hMPV感染患兒的臨床資料。 結(jié)果：收集的86份鼻咽分泌物中，有6份接種Vero-E6和LLC-MK2細(xì)胞后出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為灶性病變、圓縮、顆粒增多，無明顯合胞病變，逐漸發(fā)展為細(xì)胞脫落、漂浮。用RT

3、-PCR法成功擴(kuò)增出hMPVN、F基因片段，證實(shí)hMPV中國(guó)流行株首次分離成功。遺傳進(jìn)化樹表明此6株分離株全為A型。序列變異分析提示6株分離株之間，擴(kuò)增F基因片段的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為99．8％．100．0％和99．3％．100．0％，與代表A亞型的CAN97-83的同源性分別為99．3％-99．6％和98．7％-99．3％；與代表B亞型的CAN98-75的同源性分別為85．3％-85．6％和95．3％-96．0％。

4、在6例陽性標(biāo)本中，2例收集于冬季(12月、1月)，2例春季(5月)，2例夏季(6月、7月)。6位hMPV感染患兒年齡都小于2歲，臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、咳嗽、流涕、吼喘、呼吸急促、唇周發(fā)紺和雙肺聞及中粗濕噦音，診斷為支氣管肺炎(2／6)、毛細(xì)支氣管炎(2／6)、嬰幼兒哮喘(1／6)和上呼吸道感染(1／6)。副流感病毒3和腺病毒可為協(xié)同感染病毒病原。 結(jié)論：首次在中國(guó)大陸成功分離獲得6株hMPV，從活病毒水平證實(shí)hMPV是導(dǎo)致中國(guó)兒童下呼

5、吸道感染的重要病毒病原，臨床表現(xiàn)與呼吸道合胞病毒感染相似，并可能與哮喘發(fā)作關(guān)。采用病毒分離技術(shù)，hMPV在呼吸道感染患兒中的檢出率約為7％(6／86)。A型可能是西南地區(qū)的主要流行亞類。副流感病毒3、腺病毒能與hMPV協(xié)同感染患兒。 PARTⅡ人偏肺病毒融合蛋白基因的克隆與真核表達(dá) 目的：采用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)人偏肺病毒F蛋白。 方法：重組供體質(zhì)粒rpFastBacHT-hMPVF由美國(guó)

6、亞拉巴馬大學(xué)WayneM．Sullender教授饋贈(zèng)。在大腸桿菌DH5cz中擴(kuò)增，酶切證實(shí)后，轉(zhuǎn)化含有穿梭質(zhì)粒--Bacmid和輔助質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，提取重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-hMPVF。PCR擴(kuò)增和測(cè)序證實(shí)后，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞SF-9包裝桿狀病毒，經(jīng)數(shù)次擴(kuò)增獲得高滴度重組桿狀病毒后，感染SF-9細(xì)胞表達(dá)F蛋白，觀察細(xì)胞病變。 結(jié)果：擴(kuò)增的重組供體質(zhì)粒rpFastBacHT-hMPVF酶

7、切出現(xiàn)F基因目的片斷，轉(zhuǎn)化DHl0Bac，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-hMPVF。后者經(jīng)PCR擴(kuò)增得到3994bp片斷，測(cè)序證實(shí)無突變發(fā)生。rBacmid-hMPVF轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞SF-9獲得重組桿狀病毒。重組病毒感染新鮮SF-9細(xì)胞后，出現(xiàn)胞體變大、顆粒增多、細(xì)胞破壞直至逐漸脫落，提示F蛋白表達(dá)成功，WesternBlot鑒定須等待抗體成功制備。 結(jié)論：利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了人偏肺病毒融合蛋白，為今后研究蛋白質(zhì)結(jié)

8、構(gòu)功能和抗體、疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。 PARTⅢ人偏肺病毒主要蛋白的免疫信息學(xué)分析 目的：分別預(yù)測(cè)人偏肺病毒主要抗原即融合蛋白、黏附蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位。 方法：根據(jù)氨基酸序列，分別預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域、親水性、表面可及性與抗原性指數(shù)，綜合分析這些參數(shù)，預(yù)測(cè)蛋白的B細(xì)胞抗原表位。 結(jié)果：對(duì)于融合蛋白，N段22-25、69-84、89-96、108—142、165—169、174一177、183．

9、192、220-23l、241、380、244-252、325-327、341—346、430-435、455-470區(qū)段形成α-螺旋的可能性大；5．13、36-39、44-51、147．150、155—159、201—207、257-263、268-280、285-287、352-354、388-392、397-40l、408-4¨、416-427、436-440、475、492-500、506-508、528-530區(qū)段可能為p一折

10、疊區(qū)域；15—16、61．63、97．100、152一153、178．181、42、197、208-2¨、254-255、264、281、292-297、306-308、313-315、32l一323、330-331、355-358、367、414、393-395、404-406、488-489、502、519-522、531—534區(qū)段可能形成轉(zhuǎn)角或無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，為柔性區(qū)域。結(jié)合多種參數(shù)分析，B細(xì)胞表位可能位于N段l5-28、88一

11、lU2、l6l—l89、195-202、206-2l3、245-257、290-299、302-309、3l8-334、410-419、515-526區(qū)段。對(duì)于黏附蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為柔性區(qū)域，占62．1％，位于蛋白N端27-3l、38-39、56-77、81—124、131一146、151—167、180一183、l84—188、193-212、219區(qū)段；α一螺旋占22．37％位于蛋白N端5-26、40-46、125—130、168