人載脂蛋白O融合蛋白的構建與表達.pdf

1、目的:
　　 構建人載脂蛋白O(Apolipoprotein O，ApoO)表達質粒，采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備重組抗原apoO融合蛋白并將其純化，獲得濃度高、純度好的重組apoO。
　　 方法:
　　 以人類肝臟cDNA文庫為模板，聚合酶鏈反應(Polymerase ChainReaction，PCR)法擴增apoO DNA；將目的基因片段插入質粒pET-32a(+)相應位點構建重組質粒并轉化大腸桿菌E.co

2、li DH10B進行克隆，挑選陽性菌落進行基因測序；以測序正確的質粒轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導蛋白的表達；以Ni-NTA親和層析法純化大腸桿菌表達的apoO融合蛋白；通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳法鑒定表達的目的蛋白的正確性；并以BCA檢測法測定合成的apoO重組蛋白的濃度

3、。
　　 結果:
　　 1.PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳證實在SDS-PAGE上出現(xiàn)一條約519 bp大小的基因片段，符合預期結果。
　　 2.成功構建了pET-apoO質粒。陽性重組質粒經Bam H I和Xho I雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示有2條特異性條帶，其中1條與目的基因大小基本相同，另1條與酶切前質粒位置相近。酶切產物進行DNA測序結果顯示重組質粒的插入片段符合GenBank公布的人apoO基因序列

4、。
　　 3.IPTG誘導含重組質粒pET-apoO的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)表達重組蛋白，經SDS-PAGE電泳分析后表明在相對分子量32kD左右出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，基本符合目標蛋白分子量大小。
　　 4.經Ni-NTA柱親和純化后的apoO融合蛋白SDS-PAGE電泳分析顯示，在相對分子量34kD左右出現(xiàn)新的蛋白條帶，與目標分子量相符，且無明顯雜帶。
　　 5.根據(jù)BCA法計算重組融合蛋白a

5、poO的濃度約為0.5mg/ml。
　　 結論:
　　 成功克隆出人apoO基因，并首次大量表達出純度高的重組apoO融合蛋白。人apoO全長蛋白的成功表達，對臨床及基礎研究有著非常重要的意義。一方面，可以將其作為抗原制備針對apoO的抗體，從而為進一步檢測不同人群血漿中apoO水平與疾病的關系奠定基礎，為相關臨床研究和診斷提供工具；另一方面，可將其運用于細胞及動物模型以便對apoO的功能進行深入研究，從而有助于探討ap