人呼吸道合胞病毒融合蛋白真核表達(dá)及純化.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染最重要的病毒病原。目前尚無(wú)特異性防治方法，世界衛(wèi)生組織將發(fā)展RSV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。在RSV所編碼的11種蛋白中，融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))為跨膜糖蛋白，直接介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合、病毒的穿入、合胞體的形成，而且F蛋白在RSV不同亞型間具有高度的抗原同源性，是主

2、要的交叉保護(hù)性抗原，同時(shí)還有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別的抗原表位。本研究嘗試采用重組真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞表達(dá)RSV F蛋白，利用操作簡(jiǎn)易、純化效率高的Ni柱親和層析法完成制備和純化，獲得高純度、 g級(jí)的F蛋白，為進(jìn)一步的診斷試劑及疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)編碼F蛋白的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有F基因的質(zhì)粒pGEM3zf-F為模板，利用PCR方法，擴(kuò)增出3'端帶His標(biāo)簽和凝血酶裂解

3、位點(diǎn)的F基因序列，克隆入pGEM-Teasy載體，經(jīng)核酸序列分析后，進(jìn)一步克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，限制性內(nèi)切酶鑒定，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染COS.7細(xì)胞，48 h后用RT-PCR鑒定基因轉(zhuǎn)錄，72 h后再用Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和分布。Ni柱親和層析法純化COS-7細(xì)胞表達(dá)的F蛋白，高效毛細(xì)管電泳分析純化后蛋白純度?！　〗Y(jié)果：核酸序列分析證實(shí)獲得帶His標(biāo)簽

4、的RSV F基因序列，沒有發(fā)生無(wú)義突變。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/F-His的限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果與預(yù)期一致。轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)到F基因有轉(zhuǎn)錄，Western blot分析觀察到F蛋白特異性的表達(dá)條帶，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到F蛋白主要呈膜及胞漿分布。Ni柱法F-His蛋白純化回收率約為14.1％，高效毛細(xì)管電泳分析顯示純化后的F蛋白純度達(dá)99％以上。 結(jié)論：初步建立了RSV F蛋白真核表達(dá)及純化方