OX40L在實驗性大鼠缺血再灌注模型腦組織中的表達(dá)及其意義的研究.pdf

1、目的:缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)再灌注損傷(reperfusion injury)的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜,如興奮性氨基酸毒性作用、炎癥、細(xì)胞凋亡等,其中免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的壞死及缺血區(qū)域的炎癥性損傷成為熱點,然而,抗炎治療在腦梗死的臨床研究中仍未取得理想效果。因此,尋找新的炎癥因素并加以抑制可能為缺血性腦血管病的治療帶來新的突破。截至目前,我們實驗團(tuán)隊對諸如血小板再生生長因-

2、BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、水孔蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growthfactor,IGF-1)、IL-6、TNF-α、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、補(bǔ)體受體2、補(bǔ)體C3、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等因子在大鼠大腦缺血組織中的動態(tài)表達(dá)進(jìn)

3、行了系列研究,發(fā)現(xiàn)以上因子均積極參與了炎癥反應(yīng)過程[1-6],同時對腦心通、姜黃素、丹參酮、氧化苦參堿等中藥試劑加以篩選,試圖尋找有效抑制炎癥反應(yīng)的藥物,觀察到一定效果,但是炎癥因子數(shù)量諸多,相互之間作用復(fù)雜,以及許多病理生理機(jī)制仍未闡明,故仍需進(jìn)一步深入研究,諸多研究內(nèi)容已于國內(nèi)外期刊發(fā)表[7]。本次實驗為系列研究之一。OK40L是共刺激分子的一員。該分子系腫瘤壞死因子超家族的新成員,是OX40的天然配體,表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞

4、、B細(xì)胞、T細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞以及某些組織器官包括心、骨骼肌、睪丸和肺,有較廣泛的生物學(xué)活性,包括促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的分化成熟,增強(qiáng)T細(xì)胞功能,促進(jìn)細(xì)胞的粘附作用,參與炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫等。最新研究主要集中于動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征等,因此,研究缺血再灌注模型腦組織OX40L的表達(dá)或許可以進(jìn)一步闡明缺血再灌注的損傷機(jī)制,并為臨床缺血性腦血管病再灌注損傷提出可能的治療位點。
　　 本實驗參照Koizumi線栓法并結(jié)合本實驗室經(jīng)驗建

5、立大腦中動脈缺血再灌注(middle cerebral artery reperfusion,MCAR)模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和western blot測定缺血再灌注后大鼠大腦組織OX40L的動態(tài)表達(dá)及缺血再灌注后腦梗死體積的變化,旨在探討缺血再灌注模型大鼠大腦組織OX40L的表達(dá)和其意義。
　　 方法:
　　 1模型的制備本實驗參照Koizumi[8]線栓法建立大腦中動脈缺血再灌注(middle cerebral

6、artery reperfusion,MCAR)模型。我們實驗室依據(jù)前期實驗認(rèn)為,本模型優(yōu)點在于[9]:①無需開顱,屬相對非侵入的方法②可實現(xiàn)缺血后再灌注。同時,我們也發(fā)現(xiàn)該實驗具有一定的缺點[9]:①動物體質(zhì)量要求嚴(yán)格,一般250-300 g;②插入線拴可能影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的血液循環(huán),造成缺血后體溫升高,影響缺血結(jié)果:⑧需要一定的手術(shù)技巧;④模型實質(zhì)是栓塞性卒中,與人群常見卒中存在差異。因此,我們實驗室在參照Koizumi方法的

7、基礎(chǔ)上,密切觀察并控制以下方面:①保持室溫在26℃,室溫過低使大鼠難于蘇醒,甚至迅速死亡;②插線應(yīng)緩慢分多次拔出,否則,再灌注血流過大,引起動物缺血區(qū)出血等損傷,使動物死亡率升高;③分離血管要徹底,勿把與頸外動脈(externalcarotid artery,ECA)并行的神經(jīng)結(jié)扎,減少對頸動脈分叉下的交感神經(jīng)節(jié)損傷,胸骨甲狀肌和胸骨舌骨肌覆蓋的氣管的過度刺激,導(dǎo)致大鼠術(shù)中死亡;④插入線拴速度盡可能快,避免時間長了血管內(nèi)血栓形成;⑤術(shù)后

8、補(bǔ)足手術(shù)丟失的體液;⑥保證動物營養(yǎng),尤其術(shù)后,將飼料磨制成粉狀物以置于飼養(yǎng)籠內(nèi);⑦避免過度刺激大鼠,減少其應(yīng)激狀態(tài);⑧避免動物麻醉的二次注射和影響模型的評分及減少其腦保護(hù)作用;⑨模型評分最好于實驗動物蘇醒后半小時內(nèi)進(jìn)行。
　　 2采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機(jī)分為2組:假手術(shù)(sham)組、MCAR組。根據(jù)時間點分為6 h、24 h、48 h、72 h、96 h五個亞組。應(yīng)用Koizumi等的線栓法建立大

9、鼠MCAR模型,并至相應(yīng)時間點斷頭處死實驗動物。假手術(shù)組除不插線栓外其余操作同MCAR組。
　　 3應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測腦組織免疫陽性細(xì)胞數(shù),TTC染色測定腦梗死體積,western blot測定OX40L的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1腦梗死體積測定:
　　 TTC染色顯示:sham組腦組織均勻紅染無梗死灶,MCAR組可見大面積白色梗死灶,多位于右側(cè)基底節(jié)、頂區(qū)和顳區(qū)皮質(zhì)。腦梗死體積測定顯示:MCA

10、R組與sham組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),動物模型符合實驗要求;
　　 2腦組織免疫陽性細(xì)胞數(shù):
　　 腦組織免疫陽性細(xì)胞結(jié)果顯示:MCAR組各亞組6 h、24 h、48 h、72h、96 h OX40L未見小膠質(zhì)細(xì)胞免疫陽性者。
　　 3.腦組織western blot測定OX40L:
　　 結(jié)果顯示各組經(jīng)western blot測定未見OX40L表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 動物模型