腺病毒介導(dǎo)p21抑制視網(wǎng)膜新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病，而新生血管的生成依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的不斷分裂增殖。p21是細(xì)胞周期中重要的負(fù)性調(diào)控因子，主要參與細(xì)胞周期中G1/S期調(diào)控點(diǎn)的調(diào)控，可使細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖。本研究通過建立氧誘導(dǎo)RNV小鼠模型并檢測p21、CDK2及CyclinE mRNA和蛋白在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)，探討p21在RNV生成過程中的作用及機(jī)制；進(jìn)而應(yīng)用腺

2、病毒載體將p21基因轉(zhuǎn)染至猴視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞及RNV模型小鼠視網(wǎng)膜組織，觀察其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及RNV的抑制作用及機(jī)制。
　　方法：(1)選取7日齡C57BL/6J小鼠，共96只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組48只。實(shí)驗(yàn)組小鼠按照Smith法建立氧誘導(dǎo)RNV模型，分別于P12、P17、P22時(shí)行熒光視網(wǎng)膜鋪片及組織病理學(xué)檢查評估兩組小鼠RNV的發(fā)生情況，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-

3、polymerase chain reaction，RT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot，WB)檢測p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在兩組小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。(2)體外培養(yǎng)猴微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)，取第3～5代處于對數(shù)生長期的RF/6A接種到6孔板內(nèi)，細(xì)胞同步化后，分為磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)組、腺病毒介導(dǎo)p21基因(adenovirus

4、mediated delivery of p21，Ad-p21)組及腺病毒介導(dǎo)空基因(adenovirus mediateddelivery of non-target control，Ad-NC)組，分別應(yīng)用PBS、Ad-p21及Ad-NC轉(zhuǎn)染RF/6A，培養(yǎng)48h，行流式細(xì)胞儀、Transwell檢查及成管實(shí)驗(yàn)，行RT-PCR及WB檢測p21、CDK2及Cyclin E mRNA和蛋白在RF/6A中的表達(dá)。(3)選取7日齡C57BL

5、/6J小鼠，共80只，隨機(jī)分為對照組、PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組，每組20只。其中PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組小鼠按照Smith法建立氧誘導(dǎo)RNV模型。P11時(shí)，正常組不做任何處理，PBS組、Ad-p21組及Ad-NC組玻璃體腔分別注入PBS、Ad-p21及Ad-NC1ul。P17及P22時(shí)行熒光視網(wǎng)膜鋪片及組織病理學(xué)檢查評估RNV的發(fā)生情況，P17時(shí)行RT-PCR及WB檢測p21、CDK2及Cyclin E mR

6、NA和蛋白在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)與對照組比較，P17時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠熒光視網(wǎng)膜鋪片顯示大面積無灌注區(qū)及熒光素滲漏，視網(wǎng)膜切片可見大量突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜組織中p21 mRNA和蛋白表達(dá)較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較對照組則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)流示細(xì)胞儀結(jié)果顯示Ad-p21組RF/6A細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，G0/G1期細(xì)胞

7、較PBS組及Ad-NC組比例明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell結(jié)果顯示較PBS組和Ad-NC組，Ad-p21組RF/6A細(xì)胞穿膜能力明顯減弱，穿膜細(xì)胞數(shù)較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外成管實(shí)驗(yàn)顯示較PBS組和Ad-NC組，Ad-p21轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮細(xì)胞管數(shù)較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-p21組細(xì)胞中p21mRNA和蛋白表達(dá)較PBS組和Ad-NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較PBS組和

8、Ad-NC組則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)Ad-p21組視網(wǎng)膜無灌注區(qū)及新生血管較PBS組和Ad-NC組明顯減少。Ad-p21組視網(wǎng)膜組織p21 mRNA及蛋白表達(dá)較其余三組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CDK2和Cyclin E mRNA及蛋白表達(dá)較其余三組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：(1)p21表達(dá)降低可能是視網(wǎng)膜新生血管生成的發(fā)病機(jī)制之一。(2)Ad介導(dǎo)p21通過上調(diào)p21及下調(diào)CDK2、CyclinE的表