SHR大鼠心血管重構中VPO1表達變化及氯沙坦的干預作用.pdf

1、第一章 VPO1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠血管重構中的作用及機制
　　研究背景：
　　高血壓(Hypertension)是一種以體循環(huán)動脈收縮期和（或）舒張期血壓持續(xù)升高為主要特點的全身性疾病，其主要病理改變是血管重構和左心室肥厚，涉及實質細胞（如心肌細胞、平滑肌細胞、內皮細胞）和間質細胞（如心肌成纖維細胞、細胞外基質）的改變，引起心肌細胞體積增大和間質增生，加上由于高血壓時血管阻力增加引起左心室后負荷相應的增加，導致左心室

2、肥厚，疾病進一步惡化可導致左心衰竭;在血管表現(xiàn)為內皮細胞功能不全、平滑肌細胞增生肥大和細胞外基質沉積等。血管重構和左心室重構是高血壓發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。大量研究表明氧化應激（Oxidative stress）是高血壓血管重構和左心室重構的主要機制之一。
　　氧化應激是指機體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量蓄積引起的氧化損傷。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)和過氧化物酶是

3、血壓調節(jié)中產(chǎn)生活性氧的重要來源。血管過氧化物酶1(Vascular peroxidase1，VPO1)是新近報道的一種主要存在于心血管系統(tǒng)中的含有血紅素的過氧化物酶。已有研究表明VPO1類似于髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO），能將H2O2（弱氧化劑）催化成為HOCl（強氧化劑），促進機體細胞損傷。故推測VPO1可能在氧化應激中發(fā)揮重要作用。
　　本章選取不同周齡SHR與同周齡WKY大鼠模型對比，觀察VPO1表

4、達與胸主動脈及腸系膜動脈血管重構及氧化應激程度的關系，以及氯沙坦處理對高血壓大鼠血管重構的影響以及其可能涉及的機制。
　　方法：
　　選取4周齡雄性體重在65-85g/只的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)，適應飼養(yǎng)1周后，48只SHR大鼠隨機分為6組進行飼養(yǎng)，每組8只，同時選取周齡、性別、體重匹配的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)32只作為對照組:
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5、5周齡(week-old，wks)的SHR和WKY組（SHR5和WKY5）;
　　②8周齡SHR和WKY組（SHR8和WKY8）;
　?、?3周齡SHR和WKY組（SHR13和WKY13）;
　　④20周齡SHR和WKY組（SHR20和WKY20）;
　?、莸蛣┝縇osartan組(15mg/kg/day，Los(L));
　?、薷邉┝縇osartan組(30mg/kg/day，Los(H))。
　　

6、其中Los(L)組和Los(H)組SHR大鼠從13周齡開始給予上述劑量的氯沙坦（Losartan）灌胃，SHR組及WKY組給予等體積的生理鹽水灌胃，動物每周稱重，以調整給藥量。常規(guī)喂養(yǎng)至20周齡后終止實驗。經(jīng)左頸總動脈插管測定大鼠動脈收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)，收集血液并測定血漿中血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)的濃度。測定

7、主動脈組織勻漿中NADPH氧化酶(NOX)活性，分別提取腸系膜動脈組織RNA、胸主動脈RNA和蛋白;用Real-time PCR和Western Blot檢測VPO1的表達;4％多聚甲醛固定胸主動脈、腸系膜動脈，石蠟包埋，用于蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色以及免疫組化等形態(tài)學實驗。
　　結果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、SHR20大鼠胸主動脈及腸系膜

8、動脈血管重構明顯;
　　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿AngⅡ、H2O2水平顯著升高(P＜0.05)，主動脈組織勻漿NADPH氧化酶活性明顯增高，且SHR20大鼠升高幅度更大;
　　3.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠腸系膜動脈組織中VPO1的mRNA水平，以及胸主動脈組織中VPO1的mRNA和蛋白表達水平明顯上調;
　　4.Losartan干預呈濃度依

9、賴性降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，逆轉血管重構，同時降低SHR大鼠血漿中H2O2的濃度，降低主動脈組織中NOX活性，降低VPO1蛋白表達。
　　結論：
　　1.高血壓大鼠血管重構的機制與氧化應激程度升高有關;且VPO1表達上調與血管重構相關，其機制可能涉及NOX/VPO1途徑;
　　2.Losartan具有抗高血壓大鼠血管重構的作用，其機制可能與抑制NOX/VPO1途徑，使氧化應激程度減輕有關。
　　第二章 VPO

10、1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠左室重構中的作用及機制
　　研究背景：
　　心肌重構(myocardial remodelling)是指在多種病理情況下（如壓力超負荷、缺血、高腎素水平等）心肌組織作出的適應性反應，包括心肌細胞肥大、間質纖維化、心肌細胞凋亡等。高血壓早期的重構在短期內對正常心功能的維持具有一定的積極作用，但長期持續(xù)的重構會導致心功能逐漸惡化以至失代償而出現(xiàn)心力衰竭。新近研究表明，氧化應激在高血壓左心室重構中發(fā)揮重

11、要作用。機體內活性氧的大量蓄積和/或抗氧化能力的降低導致氧化應激損傷。機體內產(chǎn)生ROS的酶系主要包括NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)、過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、單胺氧化酶等。VPO1作為新發(fā)現(xiàn)的含血紅素的過氧化物酶家族成員之一，其主要在心血管系統(tǒng)中表達，鑒于其具有將H2O2(弱氧化劑)催化生成HOC1的特性，本章節(jié)繼續(xù)以不同周齡的自發(fā)性高血壓大鼠為模型，探討VPO1在高血壓心肌重構中的作用及機制;并探討氯沙坦抗心肌

12、重構的作用及機制。
　　方法：
　　基于第一章中動物實驗分組：
　?、賁HR5和WKY5；
　?、赟HR8和WKY8；
　　③SHR13和WKY13；
　?、躍HR20和WKY20；
　　⑤Los(H)；
　?、轑os(L)等6組動物在最終處理前完成超聲心動圖觀察心臟結構的形態(tài)及心功能指標。
　　分離全心臟并稱重（Heart weight，HW）、游離左心室并稱重(Left vent

13、ricular weight，LVW)，游離大鼠右側脛骨并測量其長度(Tibia length，TL)，計算LVW/HW和LVW/TL比值。4％多聚甲醛固定左心室，石蠟包埋，用于蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色以及免疫組化等形態(tài)學實驗;分別提取左心室組織RNA和蛋白，用Real-time PCR檢測心肌肥大標志物腦鈉素(brainnatriuretic peptide，BNP)、α-骨骼肌動蛋白(α-skeletal actin，

14、α-SA)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC) mRNA表達的變化;檢測心肌纖維化標志物Ⅰ、Ⅲ型膠原(collagenⅠ，collagenⅢ)和結締組織生長因子(CTGF) mRNA表達的變化;檢測心肌凋亡指標Bax和Bcl-2。測定左心室組織勻漿中次氯酸(hypochlorous acid，HOCl)、H2O2的濃度、NADPH氧化酶(NOX)的活性;Western Blot檢測NOX2、VPO1

15、的表達。
　　結果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、 SHR20大鼠舒張末期左室后壁和室間隔顯著增厚，左室舒張功能下降，收縮功能無明顯變化;
　　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR13、SHR20大鼠膠原沉積明顯增多，BNP、α-SA、β-MHC、Ⅰ、Ⅲ型膠原、CTGF以及Bax的mRNA表達顯著上調，Bcl-2顯著下調;
　　3.與同周齡WKY大鼠

16、比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠左心室組織勻漿中HOCl、H2O2濃度和NOX活性顯著上調，且NOX2、VPO1的mRNA和蛋白表達明顯上調;
　　4.與對照組比較，Losartan干預呈濃度依賴性抑制自發(fā)性高血壓大鼠的左心室重構，同時降低SHR大鼠中左心室組織中HOCl、H2O2濃度和NOX活性，降低NOX2和VPO1蛋白的表達。
　　結論：
　　1.高血壓大鼠左室重構，其機制可能與氧化應激程度升高有關，且

17、VPO1表達與左室重構相關，其機制可能涉及NOX/VPO1途徑;
　　2.Losartan具有抗高血壓大鼠左室重構的作用，其機制可能與抑制NOX/VPO1途徑，使氧化應激程度降低有關。
　　第三章 VPO1在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠內皮功能中的作用及機制
　　研究背景：
　　高血壓是心血管疾病的主要危險因素，越來越多的證據(jù)表明活性氧(ROS)的大量蓄積引起氧化應激是高血壓的主要發(fā)病機制。高血壓中心臟、腎臟和中樞神

18、經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生ROS的酶系有黃嘌呤氧化酶、未偶聯(lián)型一氧化氮合酶(NOS)、線粒體呼吸酶和NADPH氧化酶(NOX)。心血管系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS的主要來源是NOX，它能催化產(chǎn)生超氧化物及下游其他活性氧。NOX家族成員共有7種催化亞單位，即NOX1-5和Duox1和Duox2（雙氧化酶）。到目前為止，證實在哺乳動物的心血管系統(tǒng)中NOX催化亞單位主要是NOX2和NOX4。
　　過氧化物酶在體內分布廣泛，具有高度細胞/組織分布特異性。它參與宿主的

19、防御反應，參與生物合成甲狀腺激素、細胞外基質等，在病理條件下能催化過氧化氫(H2O2)和氯離子產(chǎn)生次氯酸，從而氧化蛋白質、脂質和DNA，導致細胞和組織。一氧化氮(NO)是內皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生的血管舒張因子，維持著血管的舒張功能。eNOS合成和/或生物利用度降低導致內皮功能障礙，而血管內皮功能障礙是高血壓導致靶器官損害及其并發(fā)癥發(fā)生的重要原因。
　　血管過氧化物酶1(VPO1)，新發(fā)現(xiàn)的過氧化物酶家族成員，在心血管系統(tǒng)

20、中，它主要在血管內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞中表達。VPO1酶學和底物特異性類似MPO，即在弱氧化劑H2O2催化生成強氧化劑次氯酸，促進血管組織的進一步氧化應激。
　　上述章節(jié)已經(jīng)得出結論VPO1涉及高血壓的發(fā)展，本章節(jié)繼續(xù)以不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠為模型，探討隨著高血壓的進展，NADPH氧化酶活性的狀態(tài)、ROS的產(chǎn)生、氧化應激程度以及VPO1是否涉及內皮功能障礙。
　　方法：
　　基于第一章中動物實驗分組，6組動物

21、:
　?、賁HR5和WKY5組;
　　②SHR8和WKY8組;
　?、跾HR13和WKY13組;
　?、躍HR20和WKY20組;
　　⑤Los(L)組;
　?、轑os(H)組。
　　每組8只，頸總動脈插管測壓后收集動脈血，測定血漿中一氧化氮(nitric oxide，NO)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)濃度，游離胸主動脈測定血管內皮依賴性舒張反應，提取胸主動脈組織中

22、RNA和蛋白，測定組織勻漿中的次氯酸(hypochlorous acid，HOCl)、3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)的濃度、 NADPH氧化酶(NOX)活性，用Real-time PCR或Westem Blot檢測NOX4、eNOS、VPO1的表達。
　　結果：
　　1.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血壓顯著升高，SHR13、SHR20大鼠出現(xiàn)內皮依賴性舒張功能不全;
　

23、　2.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿中H2O2濃度升高，胸主動脈勻漿中HOCl、3-硝基酪氨酸的濃度、NOX的活性以及NOX4 mRNA和蛋白表達顯著升高;
　　3.與同周齡WKY大鼠比較，SHR8、SHR13、SHR20大鼠血漿NO濃度、eNOS mRNA和蛋白表達顯著降低;
　　4.Losartan干預呈濃度依賴性降低大鼠胸主動脈勻漿中HOCI、3-硝基酪氨酸的濃度、NOX的活性，降低N