硫化氫對哇巴因誘發(fā)的豚鼠乳頭肌遲后去極化及觸發(fā)活動的影響.pdf

1、目的：硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳( carbon monoxide，CO)之后的第三種新型氣體信號分子。人們發(fā)現(xiàn)H2S不但可以在體內(nèi)內(nèi)源性的生成，而且還發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。內(nèi)源性H2S是由L-半胱氨酸在磷酸吡哚醛-5’-磷酸依賴性酶，即胱硫醚-β-合成酶（cystathionie-β-sythase，CBS）和胱硫醚-Y-裂解酶(cystathionin

2、e-γ-lyase，CSE)，半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化作用下產(chǎn)生的。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S在體內(nèi)多個部位都可以檢測到。在心血管系統(tǒng)內(nèi)源性H2S主要是通過CSE催化產(chǎn)生，H2S通過興奮血管平滑肌細胞上的ATP敏感性鉀離子通道（ATP sensitive K+，KATP通道），促進K+外流同時抑制Ca2+內(nèi)流，從而達到舒張血管平滑肌的作用。KATP通道也廣泛分布在心肌組織上，其開放具有重要的內(nèi)源性心臟保護機制?，F(xiàn)有的研究報告表明

3、H2S可以濃度依賴性地縮短離體豚鼠乳頭肌的動作電位時程，對部分去極化乳頭狀肌，除了能夠縮短動作電位時程之外，還可降低動作電位幅值和超射值，減慢零相最大上升速度，其機制可能通過興奮KATP通道促進K+外流，同時抑制Ca2+內(nèi)流，進而影響豚鼠乳頭狀肌電生理效應(yīng)。它對于調(diào)節(jié)整個心血管系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)具有普遍性作用。然而目前對疾病種類的研究還比較有限，對于H2S在其他一些心血管疾病例如心律失常等方面的作用及作用機制的研究也較少。
　　 由

4、遲后去極化（delayed afterdepolarization，DAD）所引發(fā)的觸發(fā)活動（triggerd activity，TA）是心律失常特別是惡性心律失常的重要發(fā)病機制之一，現(xiàn)已證實誘發(fā)遲后去極化的關(guān)鍵因素是細胞內(nèi)鈣超載。因為H2S有抑制Ca2+內(nèi)流的效應(yīng)，因此推測H2S可通過興奮KATP通道和抑制Ca2+內(nèi)流從而減輕細胞內(nèi)Ca2+超載進而抑制遲后去極化及觸發(fā)活動，并推測H2S有抗心律失常的作用。本研究用含哇巴因( Ouaba

5、in)的高鈣K-H液灌流離體豚鼠乳頭肌以誘發(fā)遲后去極化（DAD）及觸發(fā)活動(TA)，以NaHS作為H2S的供體，旨在通過應(yīng)用細胞內(nèi)微電極技術(shù)觀察H2S對哇巴因誘發(fā)的豚鼠乳頭肌遲后去極化及觸發(fā)活動的影響，并探討其可能的作用機制。
　　 方法：健康雄性豚鼠，體重300～400克/只，豚鼠擊昏后迅速打開胸腔，取出心臟，置于95％O2和5％CO2混合氣體氧飽和的冷(0～4℃)K-H液中，輕輕擠出積血，沿前室間溝右緣剪開右心室，選擇分支少

6、、大小約0.6mm×lmm×3mm的柱狀乳頭肌，用線結(jié)扎腱索端，剪下乳頭肌，用不銹鋼針固定于標(biāo)本槽底部的硅膠上。用35.5士0.5℃的K-H液（pH7.38土0.03）恒溫恒速灌流，流速4ml/min。由刺激器提供刺激頻率為2Hz，波寬為lms，強度為1.5倍閾刺激的方波信號，用雙極起搏電極以場刺激驅(qū)動標(biāo)本，產(chǎn)生動作電位。應(yīng)用含哇巴因（1lrmol/L）和高鈣(5.5mmol/L)的氧飽和K-H液灌流，誘發(fā)穩(wěn)定且可重復(fù)的遲后除極（DAD

7、）和觸發(fā)活動(TA)。用細胞內(nèi)玻璃微電極技術(shù)記錄DAD和TA諸參數(shù)，包括DAD的潛伏期、幅值、時程，TA的發(fā)生率。實驗隨機分為5組，每組6只，各組處理方案如下：
　　 1 哇巴因誘發(fā)的DAD和TA組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液平衡1小時后，記錄正常動作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液灌流，在豚鼠乳頭肌誘發(fā)DAD和TA，并觀察此時DAD和TA的特性，記錄各參數(shù)，包括DAD潛伏期

8、、幅值和時程，TA的發(fā)生率。
　　 2 H2S對哇巴因誘發(fā)的DAD和TA效應(yīng)組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液平衡1小時，記錄正常動作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液灌流，在豚鼠乳頭肌誘發(fā)DAD和TA，記錄各參數(shù)，用K-H液沖洗至DAD和TA消失，AP恢復(fù)到正常水平；然后標(biāo)本預(yù)先用含NaHS50μmol/L的K-H液灌流10min，在此基礎(chǔ)上再加入哇巴因lμmol/L和CaCl2

9、5.5mmol/L灌流標(biāo)本，分別記錄觀察DAD和TA各參數(shù)的變化，然后用K-H液沖洗并觀察AP的恢復(fù)。用同樣的方法記錄NaHS(100μmol/L、200μmol/L)時DAD和TA各參數(shù)的變化。
　　 3 KATP通道阻斷劑格列本脲(Glibenclamide，Gli)對H2S的效應(yīng)組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液中平衡1小時，記錄正常動作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液誘導(dǎo)

10、DAD和TA，并觀察記錄各參數(shù)；用K-H液沖洗至到DAD和TA消失，AP恢復(fù)到正常水平，觀察NaHS（100μmol/L）對哇巴因誘發(fā)的DAD和TA的影響，方法同2，記錄DAD和TA各參數(shù)，用K-H液沖洗并觀察AP的恢復(fù)；用含格列苯脲20μmol/L的K-H液灌流10min，之后再加入NaHSl00μmol/L灌流10min，再加入哇巴因lμmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 4 L

11、型鈣通道開放劑BayK8644(0.25μmol/L)對H2S的效應(yīng)組：觀察哇巴因誘發(fā)的DAD和TA各參數(shù)，記錄對照；觀察NaHSl00μmol/L對DAD和TA各參數(shù)的影響，記錄對照；預(yù)先用含BayK8644（0.25μmol/L）的K-H液灌流10min，之后再加入NaHSl00μmol/L灌流10min，再加入哇巴因1μmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 5 NO合酶抑制劑L-

12、NAME(1mmol/L)對H2S的效應(yīng)組：觀察哇巴因誘發(fā)的DAD和TA各參數(shù)，記錄對照；觀察NaHS100μmol/L對DAD和TA各參數(shù)的影響，記錄對照；預(yù)先用含L-NAME（1mmol/L）的K-H液灌流10min，之后再加入NaHS100μmol/L灌流10min，再加入哇巴因1μmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)預(yù)先給予NaHS（50、100、

13、200μmol/L），可劑量依賴性地抑制哇巴因所誘發(fā)的豚鼠心室乳頭肌遲后去極化(DAD)及觸發(fā)活動(TA)。NaHS（50、100、200μmol/L）可以延長DAD的潛伏期（由對照組的12.03±1.01min分別延長至14.68士1.11min、19.93士1.56min、23.68士1.25min），降低DAD的幅度(由對照組的11.47±0.74mV降至9.08±1.58mV、6.47士0.33mV、5.65士0.26mV)，縮

14、短DAD的時程（由對照組的205.18士11.09ms分別降至184.87士5.27ms、172.55±9.82ms、134.45士6.59ms），同時還可降低TA的發(fā)生率(由對照組的83％分別降至66％、33％、17％)。
　　 (2)預(yù)先應(yīng)用KATP阻斷劑格列本脲Gli（20μmol/L）可部分阻斷H2S的上述效應(yīng)；
　　 (3)預(yù)先應(yīng)用L型鈣通道開放劑BayK8644（0.25μmol/L），可完全阻斷H2S的上述