硫化氫對豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）被認(rèn)為是繼一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、一氧化碳（Carbon Monoxide，CO）之后的第三種內(nèi)源性氣體信號分子，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用。在哺乳動物組織中，內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生可以由兩種磷酸吡哆醛-5’-磷酸依賴性酶，即胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化合成。在心臟組織和動靜脈組織中，主要是由CSE催化產(chǎn)生的。以往的研究工作顯示，H

2、2S在不同組織中發(fā)揮著不同的生理功能，其作用機(jī)制也不同。在神經(jīng)系統(tǒng)，H2S通過誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生提高了NMDA（N-甲基-D-天門冬氨酸）受體的敏感性。H2S作為一種內(nèi)源性的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)了學(xué)習(xí)和記憶的過程。在心血管系統(tǒng)，H2S通過激活A(yù)TP敏感性鉀離子通道（KATP通道）使細(xì)胞膜超極化來發(fā)揮其舒血管效應(yīng)。給予外源性H2S，可以通過直接清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的積聚，來有效地保護(hù)缺血心肌細(xì)胞的收縮活性。研究表明KATP通道廣

3、泛地分布在心臟細(xì)胞中。內(nèi)源性H2S對缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用是通過蛋白激酶C的參與和開放KATP通道完成的。我們知道KATP通道狀態(tài)主要受細(xì)胞內(nèi)ATP水平的調(diào)控。提高細(xì)胞內(nèi)ATP濃度水平可導(dǎo)致KATP通道的關(guān)閉。正常心肌細(xì)胞內(nèi)有3-4mmol/L的ATP，這個濃度水平足以抑制KATP通道的活性。因此，在沒有缺血的正常生理情況下，心肌細(xì)胞中的KATP通道處于失活的關(guān)閉狀態(tài)。那么在正常生理情況下，H2S對正常心肌細(xì)胞作用的潛在機(jī)制如何?我們

4、有必要去進(jìn)一步探討。有研究證實(shí)，硫化氫可以通過抑制L-型鈣離子通道使鈣離子內(nèi)流減少，減輕鈣超載來增強(qiáng)缺血再灌注心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力。于是，我們推測H2S對正常心肌細(xì)胞的作用機(jī)制是否與L-型鈣離子通道有關(guān)。
　　 本研究主要應(yīng)用激光共聚焦顯微熒光技術(shù)，研究硫氫化鈉（NaHS，H2S的供體）對正常生理情況下豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度（[Ca2+]i）的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用酶解技術(shù)分離得到豚鼠心室肌細(xì)胞，然后用含

5、0.03％Pluronic F-127的Fluo3-AM溶液在37℃負(fù)載60分鐘，最后用激光共聚焦顯微熒光技術(shù)探測熒光信號并觀察給藥后熒光信號的變化。
　　 結(jié)果：（1）在正常臺氏液中，NaHS（50，100，200μmol/L）可以使豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度與空白對照組相比分別降低（6.35±0.88）％，（7.22±1.05）％，（8.93±1.35）％。（2）預(yù)先用L-型鈣離子通道激動劑Bay K8644可以阻斷正常臺氏

6、液中NaHS（100μmol/L）的效應(yīng)。當(dāng)預(yù)先應(yīng)用10μmol/L BayK8644后，豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯升高。100μmol/L NaHS只能使鈣熒光強(qiáng)度降低（4.18±0.68）％。（3）預(yù)先用ATP敏感性鉀離子通道（KATP通道）阻斷劑glibenclamide20μmol/L，對正常臺氏液中NaHS（100μmol/L）的作用無影響，NaHS仍然可以使鈣熒光強(qiáng)度降低（5.76±1.15）％。（4）當(dāng)預(yù)先應(yīng)用ryan

7、odine受體阻斷劑ruthenium red30μmol/L后，豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度可顯著降低，再給予NaHS（100μmol/L）后細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低（43.16±3.01）％。Ruthenium red不能阻斷NaHS對豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的抑制作用。在預(yù)先用ruthenium red后，NaHS的抑鈣作用明顯增強(qiáng)。（5）NaHS（100μmol/L）不能抑制無鈣臺氏液中由低濃度ryanodine引起的鈣熒光強(qiáng)

8、度增加。當(dāng)預(yù)先應(yīng)用1.0nmol/L ryanodine后，豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度升高。此作用不能被NaHS（100μmol/L）所抑制。（6）當(dāng)細(xì)胞外液鈣濃度由1mmol/L增加到10mmol/L而誘發(fā)心室肌細(xì)胞鈣超載時，部分心室肌細(xì)胞產(chǎn)生可傳播的鈣波，NaHS（100μmol/L）可降低鈣波的傳播速度和持續(xù)時間，從而阻斷鈣波。
　　 結(jié)論：硫化氫可以降低豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，此作用與其抑制L-型電壓門控鈣通道減少細(xì)