哮喘易感性相關粘附分子編碼基因的篩選與功能研究.pdf

1、目的：支氣管哮喘是一類復雜的炎癥性疾病，目前對哮喘的易感性機制知之甚少。本室前期研究顯示，當損傷因子作用到一定程度，氣道上皮受到損傷，其結構完整性遭到破壞以及其功能缺陷，導致局部氣道微環(huán)境失穩(wěn)態(tài)，可能是氣道高反應性疾病的始動因素。在氣道高反應或氣道炎癥發(fā)生過程中，氣道上皮表達的粘附分子發(fā)揮重要的作用，氣道上皮細胞通過表達細胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)募集炎癥細胞，啟動炎

2、癥反應；通過其表達的整合素分子將上皮細胞錨定于基膜上，及通過鈣粘素維系細胞間的同源粘附，維持上皮的結構和功能完整。因此，本研究假設粘附分子本身缺陷或表達失平衡與哮喘的易感性有關。為求證此假設，本研究①篩選了哮喘患者差異表達粘附分子，通過析因分析選擇了2個在哮喘患者中表達下調的粘附分子cateninalpha-like1、integrinbeta4，通過擴增其5’調控區(qū)序列，進行了序列變異分析；②觀察了cateninalpha-like1

3、、integrinbeta4在人支氣管上皮細胞(bronchialepithelialcells，HBECs)中的表達及對HBECs增殖和損傷修復的影響及機制，在細胞和分子水平探討哮喘的易感性機制。 方法：①提取哮喘患者外周血白細胞，抽提mRNA，逆轉錄，生物素-16-dUTP標記，獲得cDNA探針，cDNA探針和人細胞外基質與粘附分子基因芯片雜交，結果用軟件進行分析統(tǒng)計，篩選差異表達粘附分子。②PCR擴增哮喘患者表達下調的ca

4、teninalpha-like1、Integrinbeta4基因5’調控區(qū)，進行正反雙向測序及序列變異分析。③原位雜交法觀察HBECs中cateninalpha-like1、integrinbeta4的表達。④建立HBECs損傷修復指數(shù)測定方法，觀察cateninalpha-like1、integrinbeta4反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)對細胞損傷修復及增殖的影響。⑤觀察cateninalp

5、ha-like1、integrinbeta4在纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)啟動的HBECs損傷修復及增殖中的作用。⑥用Westernblot技術檢測與細胞遷移活動相關的粘附斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)磷酸化，初步探討cateninalpha-like1、integrinbeta4參與上皮細胞修復活動的機制。 結果：①哮喘易感性相關粘附分子表達譜研究：cDNA微陣列顯示哮喘患者組與正常人

6、組比較上調的粘附分子基因有15個，分別是Integrinalpha4、alphaL、alphaM、alphaV、beta1、beta8、NCAM1、P-selectin、FGB、THBS3、MMP24、TPA、Heparanase、PAI-1、PAI-2；下調的基因有integrinbeta4、cateninalpha-like1、VCAM、Vitronectin、uPA、TIMP-1共6個。析因分析顯示，integrinbeta4、c

7、ateninalpha-like1兩種分子的表達下調與哮喘易感性密切相關。②Cateninalpha-like1及integrinbeta4基因突變研究：在所有已測樣本的cateninalpha-like15’調控區(qū)轉錄起始位點上游902bp范圍內未發(fā)現(xiàn)基因變異，尚不能證實cateninalpha-like1在哮喘患者表達下調與基因變異有關。Integrinbeta4序列分析發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的-nt840、-nt839、-nt822、-n

8、t821由A突變?yōu)镃，提示哮喘患者5’調控區(qū)存在基因變異，該變異可能與基因的表達下調有關。③HBECs中cateninalpha-like1及integrinbeta4的表達：細胞爬片原位雜交觀察到未受臭氧應激的HBECs中cateninalpha-like1陽性細胞數(shù)較少，而臭氧攻擊組較未受臭氧攻擊組，陽性細胞數(shù)明顯增多。Integrinbeta4在未受臭氧應激組有較明顯的雜交信號，臭氧攻擊后，陽性信號減弱，提示此兩種分子的表達參與H

9、BECs的應激反應應答。④cateninalpha-like1ASO及integrinbeta4ASO對HBECs損傷修復及增殖的影響：結果顯示cateninalpha-like1ASO、integrinbeta4ASO明顯抑制HBECs的損傷修復及增殖。⑤cateninalpha-like1及integrinbeta4對Fn促HBECs損傷修復及增殖的介導作用觀察：檢測結果顯示，F(xiàn)n有較強的促損傷修復及促增殖能力，其效應可被酪氨酸激酶

10、途徑抑制劑Genestin阻斷。Integrinbeta4ASO預處理可抑制Fn的促損傷修復，但對Fn促細胞增殖能力無明顯影響。Cateninalpha-like1ASO處理可抑制Fn的促損傷修復及促增殖效應。⑥cateninalpha-like1及integrinbeta4表達對FAK磷酸化的影響：檢測結果顯示，F(xiàn)n可促進FAK磷酸化，并在30分鐘達到高峰，F(xiàn)n的效應可被Genestin阻斷，cateninalpha-like1可抑制

11、Fn的促FAK磷酸化效應。 結論：哮喘患者組多個粘附分子的表達出現(xiàn)異常變化。哮喘病人integrinbeta45’調控區(qū)基因序列-nt840、-nt839、-nt822、-nt821存在變異，由A變異為C。HBECs可表達cateninalpha-like1及integrinbeta4，cateninalpha-like1及integrinbeta4促進HBECs的損傷修復及增殖，并參與Fn促HBECs的損傷修復過程，但cate