乙醛脫氫酶2缺失加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心功能不全及其機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的多功能的細(xì)胞器之一，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和折疊，Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持以及脂質(zhì)的生物合成。許多生理性和病理性應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，如缺血、缺氧、氧化低密度脂蛋白、血管緊張素Ⅱ，腫瘤壞死因子α和脂質(zhì)代謝狀態(tài)的改變等。這些應(yīng)激因素能夠減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能和干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)功能，導(dǎo)致未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷積聚，從而引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，也就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。嚴(yán)重或者長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不但損

2、傷細(xì)胞的正常生理功能，還導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，參與各種疾病的病理生理過(guò)程。近年來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激越來(lái)越受到心血管領(lǐng)域研究的重視，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了心腦缺血/再灌損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚和心力衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是病理性細(xì)胞功能障礙和死亡的主要觸發(fā)者，與心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)，提示其可能成為心血管疾病的一個(gè)重要的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 乙醛脫氫酶2(Aldehyde Dehydrogenase-2，AL

3、DH2)是一種四聚體酶，主要表達(dá)于肝臟、肺臟以及一些高效產(chǎn)能器官，如心臟和腦。已知其主要作用是醛類(lèi)物質(zhì)的解毒作用，包括4-羥基壬烯酸(4-HNE)、乙醛、丙烯醛和短鏈芳烴或多環(huán)芳烴等。作為線粒體內(nèi)一種重要的醛類(lèi)氧化酶，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ALDH2通過(guò)代謝毒性醛類(lèi)物質(zhì)減小缺血引發(fā)的心肌損傷，激活A(yù)LDH2能夠使缺血/再灌所致心肌梗死面積減少60％。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明ALDH2能夠減輕乙醇、乙醛、4-HNE等活性醛類(lèi)帶來(lái)的細(xì)胞損傷及其誘導(dǎo)

4、的活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)。因此，目前ALDH2被認(rèn)為是一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　 本研究通過(guò)ALDH2基因敲除小鼠和構(gòu)建衣霉素(Tunicamycin)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激動(dòng)物模型，研究ALDH2對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的心功能不全的作用，進(jìn)一步闡述ALDH2對(duì)心血管疾病保護(hù)性作用的機(jī)制。
　　 第一部分：ALDH2基因敲除對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)

5、心功能不全的影響
　　 目的：采用ALDH2敲除小鼠模型探討ALDH2對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的心功能不全的作用
　　 方法：采用C57野生型小鼠和ALDH2敲除小鼠作為動(dòng)物來(lái)源，腹腔內(nèi)注射衣霉素(3mg/kg)，48 h后小動(dòng)物心超評(píng)估心臟功能，Western blot檢測(cè)Grp78、p-eIF2α、CHOP的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)心臟組織中的細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：采用衣霉素腹腔注射小鼠，48 h后采用小動(dòng)物

6、心超評(píng)估心臟功能，發(fā)現(xiàn)衣霉素能夠顯著誘導(dǎo)野生型小鼠心臟功能不全。與野生型小鼠相比，ALDH2基因敲除小鼠在衣霉素注射后心功能不全顯著惡化，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)減低，左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)增高，而左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)無(wú)顯著性差異。心臟組織Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)衣霉素顯著增加野生型小鼠心臟Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平；與野生型小鼠衣霉素處理組相比，ALDH2敲除小鼠在衣霉素處

7、理后，Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平顯著增加。TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在衣霉素處理后，心肌組織中的凋亡細(xì)胞顯著增加；與野生型小鼠衣霉素處理組相比，ALDH2基因敲除小鼠處理后心肌組織中凋亡細(xì)胞顯著增加。
　　 結(jié)論：ALDH2基因敲除能夠使衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物蛋白水平及凋亡顯著增加，可能介導(dǎo)了心功能不全進(jìn)一步惡化。
　　 第二部分：ALDH2對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋亡的作用
　　

8、 目的：體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ALDH2對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡的作用。
　　 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù)，通過(guò)衣霉素(5μg/ml)干預(yù)心肌細(xì)胞12 h，Western blot檢測(cè)Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平，MTT法檢測(cè)衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，Caspase-3活性檢測(cè)評(píng)估衣霉素對(duì)細(xì)胞的促凋亡作用。
　　 結(jié)果：采用Gateway技術(shù)，成功構(gòu)建的ALDH2腺病毒

9、，RT-PCR和測(cè)序證實(shí)腺病毒載體中ALDH2的序列，熒光顯微鏡證實(shí)病毒轉(zhuǎn)染成功，Western Blot證實(shí)ALDH2腺病毒感染后的心肌細(xì)胞ALDH2蛋白水平顯著增高，ALDH2 siRNA能夠顯著抑制ALDH2的表達(dá)。Western Blot證實(shí)衣霉素能顯著上調(diào)的Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平，而ALDH2腺病毒和ALDH2 siRNA干擾分別抑制和加劇了這一效應(yīng)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)衣霉素顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞毒性作用，Cas

10、pause-3活性分析發(fā)現(xiàn)農(nóng)霉素顯著增加心肌細(xì)胞的Caspase-3活性，而ALDH2腺病毒和ALDH2siRNA干擾分別抑制和加劇了衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡。
　　 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALDH2能夠顯著抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋亡，提示ALDH2在心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮著重要的保護(hù)性作用。
　　 第三部分：ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋亡的機(jī)制研究
　　 目的：研究ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的凋

11、亡的潛在機(jī)制
　　 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù)，衣霉素干預(yù)心肌細(xì)胞后，Westernblot檢測(cè)p-Akt、Akt和p47phox NADPH氧化酶蛋白水平。采用LY294002抑制P13-K，Western blot檢測(cè)衣霉素干預(yù)心肌細(xì)胞后Grp78、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平的變化，MTT法檢測(cè)衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，Caspase-3活性分析評(píng)估衣霉素對(duì)細(xì)胞的促凋亡作用。
　　

12、結(jié)果：衣霉素顯著抑制p-Akt的蛋白水平，而ALDH2腺病毒和ALDH2 siRNA分別逆轉(zhuǎn)Akt的磷酸化水平和進(jìn)一步抑制了Akt的磷酸化水平。同時(shí)，衣霉素顯著上調(diào)了p47phox亞單位的蛋白水平，而ALDH2腺病毒和ALDH2 siRNA分別能夠顯著抑制和進(jìn)一步加劇衣霉素上調(diào)的p47phox亞單位蛋白水平。NAC處理也能有效的阻斷衣霉素上調(diào)p47phox亞單位蛋白水平。LY294002抑制PI3-K后，ALDH2抑制的Grp78、p-

13、eIF2α和CHOP的蛋白水平無(wú)明顯變化，然而LY294002能夠顯著阻斷ALDH2抑制衣霉素上調(diào)p47phox亞單位蛋白水平的作用。此外，LY294002能夠顯著ALDH2抑制衣霉素上調(diào)Caspase-3活性的作用。
　　 結(jié)論：ALDH2抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的保護(hù)性作用可能是通過(guò)PI3-K-Akt-p47phox通路所介導(dǎo)。
　　 第四部分：4-HNE在ALDH2調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用
　　 目的：闡明4-H

14、NE在ALDH2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡的作用
　　 方法：采用ALDH2腺病毒和ALDH siRNA技術(shù)，通過(guò)衣霉素干預(yù)心肌細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)4-HNE adducts蛋白水平。采用4-HNE干預(yù)心肌細(xì)胞，WesternBlot檢測(cè)Grp78和p-Akt蛋白水平。
　　 結(jié)果：Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)衣霉素能夠顯著增加心肌細(xì)胞4-HNE修飾蛋白水平，而4-HNE能夠顯著抑制Akt活性，增加G