單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白G重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及鑒定.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是引起生殖器皰疹(genitalherpes，GH)的主要病原體。HSV-2感染需要實驗室檢查來確診，但我國目前HSV-2感染的實驗室診斷均依賴于價格昂貴的進口試劑。這給我國的生殖器皰疹的臨床診治工作和開展大規(guī)模的流行病學調(diào)查帶來一定的局限性。糖蛋白gG-2是抗HSV-2體液免疫應(yīng)答的主要靶位，可作為HSV-2感染的型特異性抗原，在血清分型診斷、臨床應(yīng)用及疫苗研制方面的應(yīng)用前景已得到廣泛關(guān)注。據(jù)此，本研究利

2、用質(zhì)粒表達載體pGEX-4T-1克隆和表達編碼HSV-2gG的免疫優(yōu)勢表位片段，旨在建立一種HSV-2感染早期、快速、敏感和特異的診斷方法，為進一步研制國產(chǎn)的基因工程診斷試劑奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 根據(jù)HSV-2gG編碼基因序列，針對該片段的免疫優(yōu)勢表位區(qū)設(shè)計并合成特異性引物。從生殖器皰疹患者的皰液中提取HSV-2基因組，采用PCR技術(shù)擴增獲得目的基因片段(FgG-2)并純化回收該目的片段。純化后的目的片段及質(zhì)粒載體pGEX-4T

3、-1分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，鋪于Amp陽性的LB平板上置溫箱孵育。挑取陽性單菌落置于Amp陽性的LB溶液中振蕩培養(yǎng)，取一部分培養(yǎng)液提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測定，另一部分用IPTG誘導(dǎo)表達。離心收菌后，取少量菌體沉淀進行SDS-PAGE及免疫印跡鑒定。其余的菌體沉淀經(jīng)超聲裂解破菌后再次離心，收集沉淀。加入4％SDS將該沉淀振蕩使其充分溶解，離心收集上清并進行SDS-PAGE電泳檢測

4、。用GST柱純化該蛋白，再次SDS-PAGE電泳檢測純化的目的蛋白。以獲得的HSV2-gG/GST融合表達蛋白作抗原，ELISA間接法檢測已知的抗HSV-2IgG陽性血清、抗HSV-2IgM陽性血清及正常人血清。 在退火溫度為52℃時擴增出與預(yù)期結(jié)果相符的目的基因片段1241bp。重組質(zhì)粒的PCR鑒定及雙酶切鑒定可擴增出與目的基因片段大小一致的DNA片段。初步證實目的基因片段FgG-2已正確插入質(zhì)粒載體pGEX-4T-1中。經(jīng)過

5、比對分析，結(jié)果顯示所測得的DNA序列與目的基因序列一致，且閱讀框架正確。進一步證實DNA插入序列正確。重組表達蛋白rFgG-2的SDS-PAGE電泳檢測顯示誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒菌在分子量約66.2kD處出現(xiàn)特異蛋白條帶，與預(yù)測的大小相符。對該產(chǎn)物進行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示在非誘導(dǎo)表達條件下的表達產(chǎn)物未出現(xiàn)與HSV2-gG單克隆抗體McAb反應(yīng)的條帶；而IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的rFgG-2蛋白與McAb出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶。表明誘導(dǎo)表達的rFgG-2蛋

6、白抗原與HSV2-gG的McAb具有良好的抗原性和特異性。GST柱純化獲得的融合表達蛋白HSV2-gG/GST，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測顯示在66.2kD處出現(xiàn)一條清晰的特異蛋白條帶。表明已獲得純化的HSV2-gG/GST融合蛋白。間接ELISA檢測顯示，該融合蛋白抗原能分別與抗HSV-2IgG陽性血清、抗HSV-2IgM陽性血清反應(yīng)，而不與正常人血清反應(yīng)。表明HSV2-gG/GST融合蛋白抗原對抗HSV-2陽性血清抗體具有較好的抗原