日本腦炎病毒核心蛋白編碼基因重組質粒構建及鑒定.pdf

1、目的：本實驗通過RT-PCR法構建重組質粒pJC，并通過間接免疫熒光法探究重組質粒pJC在CHO細胞株中能否進行表達及其分布，為研究日本腦炎病毒結構蛋白間相互作用及病毒毒力等研究奠定基礎。 方法： 一、實驗材料 1、細胞、質粒及菌株。中華倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞購自中國科學研究院上海細胞庫，生長于37℃，5％CO2及含10％胎牛血清(Fatal calf serum，F(xiàn)C

2、S)的Dulbecco modified eagle medium(D—MEM)高糖培養(yǎng)液中；BALB/c鼠購自中國科學院上海實驗動物中心；含F(xiàn)LAG片段的JEV C蛋白編碼基因重組質粒被命名為pJC，由本實驗室構建；真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司，用于JEVC蛋白編碼基因重組子的構建；大腸桿菌JM109與DH5α購自Takara公司，用于重組質粒構建、轉化。 2、試劑及抗體。RNA抽提試劑(Co

3、de No．D312)，RT-PCR試劑盒(Code No．DR027A)，DNA片斷純化試劑盒(Takara，product No．DV807)，DNA A尾試劑盒(Takara，product No。D404)，瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(Takara，product No．DV805)，DNA連接試劑盒(Takara，product No．D6023)，質粒小劑量提取試劑盒(Takara，product No．DV801A)，限制

4、性內切酶EcoRI、BamHI均購自Takara公司，用于重組質粒的構建和酶切鑒定。脂質體(Lipofectamine2000)購自Invitrogen公司，用于CHO細胞轉染。氨芐青霉素購自Sigma公司，瓊脂糖購自Takara公司，用于質粒的轉化和電泳分析；D—MEM高糖培養(yǎng)液，10％FCS，青霉素購自?？坡」荆糜贑HO細胞的培養(yǎng)；熒光二抗購自cell signaling公司，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金

5、橋公司，用于質粒轉染后的免疫熒光檢測。 二、實驗方法 1.JEV C蛋白編碼基因重組質粒構建。以日本腦炎病毒SA14—14—2株Total RNA為模板，運用RT-PCR方法擴增日本腦炎病毒核心蛋白C基因，并在基因兩側加入起始密碼子與終止密碼子，然后在基因兩側加入BamHI/EcoRI酶切位點。反轉錄引物：5'GAATTCTTAGGCTC——CTGCACAAGCTATGAC3’，限制性內切酶EcoRI(—GAA TTC—

6、)合成至日本腦炎病毒核心蛋白C編碼基因5’末端。PCR法擴增前向引物5'GGATCCATGACTAA——AAAACCAGGAGGGC3’，BamHI(—GGA TCC—)合成于5’末端，反向引物為上述反轉錄引物。1％瓊脂糖凝膠電泳并回收最終PCR產物，后者與pMD19-T simple連接構建重組子pMD—JC。使用PrimeSTAR() HS DNA Polymerase(CodeNo．DRO——10S)，對重組質粒pMD—JC以CT

7、B905 F(5'CGGGATCCATGGACTACAAGG——ACGACGATGACAAGATGACTAAAAAACCAGGAGGG3')為引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver．2.0(C——ode No． DV805A)進行切膠回收約500bp的片段后，使用BamHI/EcoRI進行酶切，經(jīng)乙醇沉淀后，命名為Insert DNA；將質粒pcDN

8、A3.1(+)使用BamHI/EcoRI進行酶切，然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver．2.0(Code——No．DV805A)切膠回收約5.4kbp的DNA片段后，命名為Vector DNA；使用Ta——KaRa DNA Ligation Kit(Code No． D6022)中的Solution I將Insert DNA和Vec—-Tor DNA連接后，熱轉化至E.coli

9、Competent Cell JM109(Code No． D9052)中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取質粒命名為pJC，使用引物BGHrev對上述質粒進行測序，結果正確。轉化pJC于大腸桿菌DH5α，小劑量提取質粒并經(jīng)BamHI/EcoRI酶切電泳鑒定。 2.JEV C蛋白編碼基因重組質粒轉染CHO細胞。采用脂質體轉染法將pJC轉染CHO細胞，同時設空載體pcDNA3.1(+)轉染細胞與未轉染細胞為陰性對照

10、。具體方法為：1.轉染實驗前天以4×105細胞/mL接種CHO細胞于6孔板中(每孔1mL)，37℃，5％CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h至轉染當天細胞達到90％以上匯合。2.轉染：胰酶消化轉染用的CHO細胞，將其接種于6孔板中的蓋玻片，以蓋滿玻片不溢出為度，于37℃，5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)24h至轉染當天細胞達到90％以上匯合；配制脂質體/質粒混合物：溶液A：將重組質粒pJC和空載體pcDNA3.1(+)各4μg(每孔)加入D—MEM培養(yǎng)

11、液中，溶液總體積各為250μl(每孔)，輕輕混勻；溶液B：將10μl脂質體加入240μlDMEM培養(yǎng)液中，共四管，輕輕混勻，室溫孵育5min；將稀釋的重組質粒pJC和空載體pcDNA3.1(+)分別與250μl脂質體稀釋液輕輕混勻，室溫孵育20min(這時溶液會變渾濁)以形成脂質體/質?；旌衔?；用無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液洗細胞3次，轉染前的短時間內更換1ml37℃預溫好的無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液；向6孔板中逐滴加入500

12、pl脂質體/質粒混合物，邊加邊搖動培養(yǎng)板；在37℃，5％的CO2中培養(yǎng)5—6小時后用無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，更換含有10％FCS的D—MEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)72h；以備下一步做免疫熒光用。 3.免疫熒光檢測。6孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)pJC轉染的CHO細胞，待細胞密度達到60％—70％時，4％多聚甲醛固定細胞1h，0.1％Triton—100打孔10min，10％BSA封閉1h，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG(H+L

13、)4℃過夜孵育，熒光二抗37℃避光孵育1h，50％甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察。 結果：1、JEV C蛋白編碼基因重組質粒的構建。以日本腦炎病毒SA14—14—2株Total RNA為模板，經(jīng)RT-PCR法獲得含有FLAG片段的JEV C蛋白編碼基因重組子pJC，測序分析與發(fā)表的基因序列相符合。經(jīng)酶切鑒定表明：重組質粒經(jīng)BamHI/EcoRI酶切釋出的插入子相對分子量為500bps與pJC經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致，

14、應用pcDNA3.1 T7噬菌體啟動子引物測序分析目的基因在真核表達載體中正常連接。2、JEV C蛋白編碼基因重組質粒轉染的CHO細胞的免疫熒光檢測。JEV C蛋白編碼基因重組質粒轉染的CHO細胞可見較顯著綠色熒光標記，主要分布在胞漿，少量分布于胞膜?？蛰d體轉染或未進行轉染的CHO細胞中未見特異性綠色熒光標記，僅見散在的非特異性綠色熒光雜質。 結論：1、構建的重組子pJC含有JEV C蛋白編碼基因。2、轉染了JEV C蛋白編碼基