表達基因Ⅶ型新城疫病毒HN糖蛋白的重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建及其免疫效力試驗.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種烈性、高度傳染性疾病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前，常規(guī)疫苗毒株大多是NDV基因Ⅰ型或基因Ⅱ型，而當前我國優(yōu)勢流行毒株為NDV基因Ⅶ型，雖然它們屬于同一血清型，但遺傳距離相差較遠。因此，免疫雞群中非典型ND和帶毒現(xiàn)象普遍存在，免疫失敗時有發(fā)生，迫切需要研制與流行毒株基因型相匹配的ND疫苗?；痣u皰疹病毒

2、（herpesvirus of turkey，HVT）疫苗是預(yù)防雞馬立克氏病的常用疫苗，具有較多的病毒復(fù)制非必需區(qū)可供外源基因的插入，被廣泛應(yīng)用于重組病毒活疫苗的構(gòu)建。本研究擬以HVT FC126疫苗株為載體，構(gòu)建表達基因Ⅶ型NDV HN糖蛋白的重組火雞皰疹病毒，研制新型ND活疫苗。
　　本研究通過PCR擴增出基因Ⅶ型NDV DT-2014株的HN基因，與人巨細胞病毒早期啟動子(CMV)和TK poly A組成表達盒。將該表達盒插

3、入到HVT FC126疫苗株的US2非必需區(qū)片段中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pHVT-US2-HN。將pHVT-US2-HN轉(zhuǎn)移載體與表達EGFP標志基因的重組HVT FC126病毒(rHVT-EGFP)基因組DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEF)，經(jīng)同源重組，將EGFP基因替換為HN基因表達盒，獲得表達HN蛋白的重組病毒rHVT-US2-HN。通過PCR、Southern-blot、Western-blot和間接免疫熒光試驗(IFA)對獲得的重組病

4、毒rHVT-US2-HN進行鑒定，并對其在CEF上的生長特性進行檢測。結(jié)果顯示:重組病毒rHVT-US2-HN中，HN基因表達盒已正確插入US2復(fù)制非必需區(qū)內(nèi)，并能成功表達大小在70kD左右的目的蛋白。同時，重組病毒rHVT-US2-HN在CEF上表現(xiàn)出了與HVT FC126疫苗毒株相同的復(fù)制水平。
　　本研究對重組病毒rHVT-US2-HN進行了免疫效力的初步評價。將80只1日齡SPF雞隨機分成4組，依次為rHVT-US2-HN

5、免疫組、弱毒疫苗免疫組、攻毒對照組及空白對照組。其中，rHVT-US2-HN免疫組于1日齡頸部皮下接種5000噬斑形成單位(PFU)的rHVT-US2-HN;弱毒疫苗組于7日齡經(jīng)滴鼻/點眼途徑免疫1羽份LaSota疫苗。分別于7、14、21、28日齡采血分離血清，通過血凝抑制試驗(HI)檢測NDV抗體效價。除空白對照組外，其余3組于21日齡經(jīng)滴鼻點眼途徑以每只雞105EID50的基因Ⅶ型NDV DT-2014株攻毒。攻毒后第3d、5d，