中藥疫毒清制劑抗流感病毒作用研究.pdf

1、目的： 疫毒清(Depestia)為鴨跖草(CommelinacommunisL)提取物(總生物堿類)。中藥鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草(CommelinacommunisL)的地上部分。采用滲漉技術(shù)和離子交換技術(shù)提取鴨跖草中具有抗病毒作用的生物堿類成分，制備得到疫毒清制劑。分別作體內(nèi)和體外抗流感病毒研究，體外以MDCK細(xì)胞為研究對(duì)象，體內(nèi)以昆明小鼠為研究對(duì)象，評(píng)估疫毒清的藥效。 方法： 1、病毒的增殖與滴定：流感

2、病毒A采用雞胚和MDCK細(xì)胞增殖，以血凝實(shí)驗(yàn)判斷病毒效價(jià)，MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒TCID50滴定。 2、疫毒清體外抗病毒實(shí)驗(yàn)：將疫毒清由母液對(duì)半稀釋得到濃度梯度。MTT法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)在無(wú)毒濃度范圍內(nèi)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入不同濃度的藥物0.1ml，吸附100TCID50的病毒液0.1ml；采用治療組和預(yù)防組兩種給藥方式，每日觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，約在病毒對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)+++CPE時(shí)用MTT法染色測(cè)各孔570nm

3、處OD值并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(半數(shù)有效濃度)得到藥物的治療指數(shù)。 3、疫毒清體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)：小鼠滴鼻感染流感病毒，建立病毒感染的動(dòng)物模型。死亡保護(hù)作用：將60只小鼠(SPF級(jí)，18～20g，雌雄各半)隨機(jī)分為6組，每組10只。將給藥組與模型組的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后給藥組分別灌胃給予高、中、低濃度的疫毒清與病毒唑，持續(xù)給藥7天，觀察14天，每天觀察并記錄動(dòng)物的反應(yīng)、出現(xiàn)死亡的時(shí)間和死亡數(shù)。對(duì)流感病毒所致肺炎的影

4、響：將給藥組與模型組的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后給藥組分別灌胃給予高、中、低濃度的疫毒清與病毒唑，持續(xù)給藥7天，處死動(dòng)物，無(wú)菌取肺，稱肺重，肉眼觀察肺臟變化，計(jì)算肺指數(shù)和肺病變抑制率，并做小鼠肺組織病理切片觀察。 4、小鼠肺組織勻漿做RT—PCR流感病毒核酸檢測(cè)： 取100mg肺組織經(jīng)過(guò)總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)流感病毒RNA的相對(duì)含量，比較給藥組與模型組的差別。 此反應(yīng)還

5、包括設(shè)計(jì)引物，確立反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件等步驟。 結(jié)果： 1、MTT試驗(yàn)：藥物組各濃度的光密度OD值(代表活細(xì)胞數(shù)目)與病毒對(duì)照組的光密度進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，在高濃度時(shí)，P＜0.05，有顯著性差異，說(shuō)明疫毒清制劑能夠抑制流感病毒增殖，使較多的細(xì)胞存活。 2、常規(guī)檢測(cè)中，疫毒清各劑量組對(duì)小鼠的肺指數(shù)均顯著低于病毒模型組，P＜0．01；存活天數(shù)明顯高于病毒模型組P＜0.05或P＜0．01。 3、RT—PCR檢測(cè)：

6、流感病毒RNA的含量(105拷貝/L)為高劑量組：39.29±6.06、中劑量組：36.09±8.19、低劑量組：40.36±8.62均與病毒模型組：50.16±6.73有顯著性差異，P＜0.05。 結(jié)論： 疫毒清體外實(shí)驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)的治療指數(shù)(11.06和11.75)，可見(jiàn)疫毒清對(duì)流感病毒的治療與預(yù)防，均顯示了一定的效果，具有抗流感病毒的作用。疫毒清體內(nèi)實(shí)驗(yàn)肺指數(shù)，存活天數(shù)，肺組織勻漿流感病毒含量，肺組織病理切片等實(shí)驗(yàn)結(jié)果