豹皮樟總黃酮對睪丸間質(zhì)細(xì)胞中奧沙利鉑作用的影響及其可能機制.pdf

1、目的：
　　1.觀察豹皮樟總黃酮（Total Flavonoids of Litsea Coreana，TFLC）對睪丸間質(zhì)正常/腫瘤細(xì)胞縫隙連接（Gap Junction，GJ）功能和連接蛋白43（connexin43， Cx43）表達(dá)的影響。
　　2.分別觀察TFLC在睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞（I-10）和睪丸間質(zhì)正常細(xì)胞（TM3）中對奧沙利鉑（oxalipatin，OHP）細(xì)胞毒性的影響及其這種影響與GJ的關(guān)系。
　　3

2、.探討TFLC影響奧沙利鉑抗增殖及誘導(dǎo)凋亡作用的可能機制。
　　方法：
　　1.TFLC對睪丸間質(zhì)細(xì)胞中GJ功能的影響
　　1.1細(xì)胞接種熒光示蹤法檢測不同濃度TFLC對睪丸間質(zhì)細(xì)胞GJ功能的影響。
　　1.2 Western blotting和細(xì)胞免疫熒光法檢測不同濃度的TFLC（0、5、10、20μg/ml）分別作用于睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞（I-10）和睪丸間質(zhì)正常細(xì)胞（TM3）24 h，對細(xì)胞Cx43總蛋白和膜表

3、面Cx43蛋白表達(dá)的影響。
　　2. TFLC對OHP細(xì)胞毒性的影響
　　2.1用接種不同密度細(xì)胞的方法，獲得生長融合細(xì)胞（高密度，有條件形成GJ）與生長未融合細(xì)胞（低密度，無條件形成GJ），在上述不同接種密度的細(xì)胞中，采用MTT法分別觀察OHP對I-10和TM3細(xì)胞的毒性。
　　2.2為了進(jìn)一步驗證TFLC對OHP細(xì)胞毒性的影響與GJ有關(guān)，我們采用siRNA法成功干擾掉兩株細(xì)胞中Cx43蛋白后，檢測TFLC對OHP細(xì)

4、胞毒性的影響。
　　3. TFLC對OHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響
　　3.1在有GJ形成的條件下，先用20μg/ml TFLC預(yù)處理I-10和TM3細(xì)胞24 h，再用30μM OHP處理對應(yīng)細(xì)胞8 h，然后采用Annexin V/PI雙染法觀察TFLC對OHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的變化。
　　3.2在有GJ形成的條件下，采用Hoechst33258熒光染色法檢測20μg/ml TFLC作用細(xì)胞24 h后，對OHP誘導(dǎo)細(xì)胞晚期

5、凋亡情況的影響。
　　4. TFLC對OHP作用后凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)和caspase3、caspase9的影響
　　先用20μg/ml TFLC處理I-10和TM3細(xì)胞24 h后，再用10μM OHP處理24 h，然后采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)和caspase3、caspase9的剪切情況。
　　結(jié)果：
　　1. TFLC增強睪丸間質(zhì)細(xì)胞（I-

6、10和TM3）GJ功能
　　1.1細(xì)胞接種熒光示蹤結(jié)果顯示TFLC（0、5、10、20μg/ml）分別處理I-10和TM3細(xì)胞24 h，可以顯著增強GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞。在I-10細(xì)胞中，與對照組相比， TFLC處理后細(xì)胞的熒光傳遞功能分別增加了20.12％±20.06%（P>0.05）、50.00%±7.30%（P<0.05）和155.00%±13.40%（P<0.01）；在TM3細(xì)胞中，與對照組相比，TFLC處理后細(xì)胞的熒

7、光傳遞功能分別增加了36.50%±2.90%（P<0.05）、85.00%±2.12%（P<0.05）和180.00%±1.41%（P<0.01）。結(jié)果表明，在I-10和TM3細(xì)胞中TFLC均可以顯著增強GJ功能。
　　1.2采用Western blotting檢測TFLC對兩株睪丸細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：在睪丸腫瘤細(xì)胞I-10中，隨著TFLC濃度的增加Cx43表達(dá)水平相應(yīng)升高；同樣在睪丸正常細(xì)胞TM3中，隨著TFLC

8、濃度的增加Cx43表達(dá)水平也相應(yīng)升高。
　　1.3細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果與Western blotting實驗結(jié)果一致：在I-10細(xì)胞中，隨著TFLC濃度的增加，膜表面Cx43表達(dá)水平相應(yīng)升高；同樣在TM3細(xì)胞中，隨著TFLC濃度的增加，膜表面Cx43表達(dá)水平也相應(yīng)升高。
　　2. TFLC對OHP細(xì)胞毒性的影響
　　2.1 MTT法檢測結(jié)果顯示在高密度接種（有GJ形成）條件下，用20μg/ml TFLC增強GJ功能后，1

9、0μM OHP處理I-10和TM3細(xì)胞24 h。在I-10細(xì)胞中，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率顯著低于OHP單用組（P<0.01）；而在低密度接種（無GJ形成）條件下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率與OHP單用組無顯著差別（P>0.05）。同時在 TM3細(xì)胞中，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率顯著高于 OHP單用組（P<0.01）；而在低密度接種（無 GJ形成）條件下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率與 OHP單用組無明顯差異（P>0.05）。
　　2.2 siRNA

10、法結(jié)果顯示：在I-10細(xì)胞中，抑制Cx43后，TFLC和OHP的聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率與OHP單用組無顯著差異（P>0.05），而在未轉(zhuǎn)染時聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率顯著低于OHP單用組（P<0.05）；在TM3細(xì)胞中，抑制Cx43后，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率與OHP單用組無顯著差異（P>0.05），而在未轉(zhuǎn)染時聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率明顯高于OHP單用組（P<0.05）。
　　以上結(jié)果均表明，在 I-10細(xì)胞中 TFLC可以通過增強 GJ功

11、能而顯著增強OHP的細(xì)胞毒性；而在TM3細(xì)胞中TFLC增強GJ功能反而會顯著抑制OHP的細(xì)胞毒性。
　　3. TFLC對OHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響
　　3.1 Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示在高密度接種（有GJ形成）條件下，在 I-10細(xì)胞中，用20μg/ml TFLC增強GJ功能后，30μM OHP處理細(xì)胞8 h，細(xì)胞凋亡率顯著高于OHP單用組（P<0.05）；而在TM3細(xì)胞中，用20μg/ml TFLC增強GJ功能后

12、，30μM OHP處理細(xì)胞8 h，細(xì)胞凋亡率顯著低于OHP單用組（P<0.01）。
　　3.2 Hoechst33258熒光染色結(jié)果也顯示有GJ形成的條件下，在I-10細(xì)胞中，用20μg/ml TFLC增強GJ功能后，20μM OHP處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞晚期凋亡率顯著高于OHP單用組（P<0.05）；而在TM3細(xì)胞中，用20μg/ml TFLC增強GJ功能后，20μM OHP處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞晚期凋亡率顯著低于 OHP單用組

13、（P<0.01），單用TFLC組與對照組的細(xì)胞凋亡率無顯著差異。
　　結(jié)果表明，在I-10細(xì)胞中TFLC可以顯著增強OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，而在TM3細(xì)胞中TFLC明顯減輕OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。
　　4. TFLC對OHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　Western blotting結(jié)果顯示：在I-10細(xì)胞中，20μg/ml TFLC預(yù)處理細(xì)胞24 h后，與單用OHP組相比可以顯著增強促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，而

14、抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。而在TM3細(xì)胞中，同樣的處理，與單用OHP組相比，預(yù)處理可以明顯降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，而增強抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡過程中的重要環(huán)節(jié)，本實驗還檢測了 caspase3、caspase9的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示：在I-10細(xì)胞中，與單用OHP組相比，聯(lián)合用藥組的caspase3和caspase9的剪切均明顯增多；而在TM3細(xì)胞中，與單用OHP組相比，

15、聯(lián)合用藥組的caspase3和caspase9的剪切均明顯減少。
　　綜合上述結(jié)果表明，在睪丸腫瘤細(xì)胞I-10中TFLC可以通過增強caspase3、caspase9的剪切和上調(diào)Bax/Bcl-2的表達(dá)而增強OHP的細(xì)胞毒性；而在睪丸正常細(xì)胞TM3中TFLC卻減少caspase3、caspase9的剪切和下調(diào)Bax/Bcl-2的表達(dá)而減輕OHP的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)論：
　　1. TFLC增強I-10和TM3細(xì)胞中GJ功