奧沙利鉑誘導胃癌細胞壞死的機制研究.pdf

1、背景及目的：胃癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，手術和化療是主要的治療方式。在各種化療藥物中，鉑類是胃癌治療的常用藥物，如順鉑、奧沙利鉑，它們屬于DNA烷化劑，進入細胞后會形成鉑類-DNA加合物，導致DNA發(fā)生鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，損傷 DNA。一般認為 DNA損傷是通過誘導內(nèi)源性的凋亡途徑而導致細胞死亡的，然而越來越多的證據(jù)表明鉑類藥物的作用機制可能不止是凋亡，壞死也可能參與其中。長久以來壞死被認為是由外界壓倒性刺激因素引起的被

2、動的、意外的、無序的死亡方式，和凋亡的有序調(diào)控相比，其作用一直被忽視。2005年，Degterev等在小鼠缺血再灌注損傷模型中提出程序性壞死（necroptosis）的概念，并鑒定出一種特異的抑制劑 necrostatin-1（Nec-1），顛覆了人們對壞死的認識。這十年里，程序性壞死被發(fā)現(xiàn)參與了許多病理生理過程，且多種因素都可以引起程序性壞死的發(fā)生。盡管目前對它的信號通路還不清楚，但是也取得了一些成果，其中最主要的是腫瘤壞死因子家族引

3、起的受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase3，RIP3）依賴的途徑和DNA烷化劑引起的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly[ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1）介導的途徑。在前期的工作中，我們使用Nec-1這個工具，發(fā)現(xiàn)它能顯著地抑制奧沙利鉑誘導的SGC-7901胃癌細胞死亡，這令我們相信奧沙利鉑作用后引起的主要是壞死。本研究擬探索奧沙利鉑誘導胃癌細胞死亡

4、的方式，尤其是壞死在其中的作用，剖析RIP3依賴的途徑和PARP-1介導的途徑在其中的參與情況。凋亡和壞死可能是化療藥物誘導腫瘤細胞死亡中普遍存在的兩種結局，相對于研究得非常透徹的凋亡，壞死無疑是個新的未知領域。弄清楚壞死的發(fā)生過程，明確它和凋亡之間的關聯(lián)，找到更有效地殺死腫瘤細胞的辦法，將為克服腫瘤細胞對化療藥物的抵抗提供新思路。
　　方法：Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡和壞死；Hoechst33342/PI

5、染色熒光顯微鏡觀察細胞核和細胞膜的變化；JC-1染色流式細胞術分析線粒體膜電位的改變；Western blot檢測caspase-9、caspase-3、PARP-1的活化以及抗凋亡的Bcl-2家族蛋白和IAP家族蛋白的變化；提取細胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA ladder是否出現(xiàn)；比色法檢測細胞培養(yǎng)上清中的LDH活性；Western blot檢測CypA和HMGB1的釋放；透射電鏡觀察細胞的超微結構；DCF-DA染色流式細胞術檢

6、測細胞內(nèi)的ROS水平；Western blot檢測LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉變；實時定量PCR和Western blot檢測Bmf在mRNA和蛋白表達水平的變化；MTS法檢測RIP1的抑制劑（Nec-1）、MLKL抑制劑（NSA）、Drp1抑制劑（Mdivi-1）、廣譜caspases抑制劑（z-VAD-fmk）和PARP-1抑制劑（olaparib）對奧沙利鉑所致SGC-7901細胞死亡的影響；轉染RIP1 siRNA、RIP3 si

7、RNA和PARP-1 siRNA后用實時定量PCR和Western blot方法驗證轉染效果，MTS法檢測轉染后對細胞死亡的影響；熒光顯微鏡和Western blot方法觀察PAR的形成和H2AX的磷酸化；比色法檢測細胞內(nèi)NAD+水平；熒光素/熒光素酶法檢測細胞的ATP水平；激光共聚焦顯微鏡和Western blot方法觀察tAIF的移位；Western blot檢測奧沙利鉑作用早期p38、JNK和ERK1/2的磷酸化（活化）情況；MT

8、S法檢測分別用p38抑制劑 SB203580、JNK抑制劑SP600125或位于ERK1/2上游的激酶MEK1/2抑制劑U0126預處理對奧沙利鉑所致細胞死亡的影響。
　　結果：奧沙利鉑處理SGC-7901細胞后，大多數(shù)細胞表現(xiàn)為Annexin V（+）/PI（+），少數(shù)為Annexin V（+）/PI（?）；Hoechst33342/PI染色見細胞核固縮、碎裂，紅色熒光出現(xiàn)，說明細胞膜破裂；瓊脂糖凝膠電泳沒有觀察到DNA lad

9、der，只是在48 h出現(xiàn)彌散狀的條帶；線粒體膜電位隨著奧沙利鉑作用時間延長而逐漸下降；caspase-9、caspase-3的活化和PARP-1的裂解出現(xiàn)在奧沙利鉑作用24 h后；Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、cIAP1和cIAP2在奧沙利鉑處理前后沒有明顯改變，唯有 XIAP有所下降；z-VAD-fmk能部分地抑制奧沙利鉑引起的細胞死亡；奧沙利鉑處理36 h后細胞培養(yǎng)上清中的LDH活性顯著升高；CypA在處理后36 h釋放入

10、上清，比HMGB1要早；透射電鏡觀察到細胞膜完整性喪失、細胞內(nèi)容物外漏、染色質固縮；壞死過程不伴有ROS的升高和自噬的發(fā)生，而Bmf在mRNA和蛋白水平均逐漸升高；Nec-1能顯著地抑制奧沙利鉑所致的細胞死亡，能使細胞存活率達到90％以上，而NSA或Mdivi-1對細胞死亡無影響；Nec-1還能抑制LDH和CypA、HMGB1釋放入上清；轉染RIP1 siRNA后能部分抑制奧沙利鉑引起的細胞死亡，而轉染RIP3 siRNA對細胞死亡無影

11、響；大分子聚合物PAR在奧沙利鉑作用后形成；細胞內(nèi) NAD+和ATP水平隨著奧沙利鉑作用時間延長而快速下降；奧沙利鉑引起組蛋白H2AX在Ser139位點發(fā)生磷酸化；tAIF在奧沙利鉑處理后從線粒體移出，進入細胞漿，最終進入細胞核；olaparib能通過抑制PARP-1的活化而抵抗奧沙利鉑所致的細胞死亡，并能阻止LDH釋放、NAD+和ATP的下降以及tAIF的移位；轉染PARP-1 siRNA也能抑制奧沙利鉑引起的細胞壞死；奧沙利鉑處理6

12、 h后p38發(fā)生磷酸化，而ERK1/2和JNK在未處理的SGC-7901細胞中就處于磷酸化狀態(tài)，奧沙利鉑處理6 h后pERK1/2降低，pJNK沒有明顯的變化；U0126或SB203580預處理可以增加細胞存活率，而SP600125對奧沙利鉑所致的細胞死亡無影響。
　　結論：奧沙利鉑能誘導胃癌細胞SGC-7901發(fā)生凋亡和壞死；盡管caspase級聯(lián)反應被激活，但caspase活化的程度有限，凋亡似乎是可有可無的，而壞死才是主要的

13、死亡方式；這種壞死不伴有ROS的升高和自噬的發(fā)生，但卻可以上調(diào)Bmf的表達；RIP1是該信號通路中的關鍵分子，Nec-1幾乎能完全阻止細胞死亡；RIP3及其下游的MLKL、PGAM5以及Drp1并不參與壞死信號傳導；奧沙利鉑通過激活PARP-1而消耗細胞內(nèi)的能量是導致壞死的原因，抑制PARP-1就可以抑制壞死的發(fā)生；H2AX在Ser139位點發(fā)生磷酸化和tAIF從線粒體移位到細胞核參與了奧沙利鉑引起的SGC-7901細胞壞死過程；JNK