縫隙連接蛋白Cx43形成的GJIC對奧沙利鉑體外抗睪丸癌作用的影響.pdf

1、目的：⑴檢測睪丸正常細(xì)胞（TM3、TM4）和睪丸腫瘤細(xì)胞（I-10）中縫隙連接蛋白43（connexin43,Cx43）的表達(dá)。⑵運(yùn)用GJ工具藥，改變GJ功能后，觀察奧沙利鉑（oxalipatin, OHP）細(xì)胞毒性的變化。⑶探討縫隙連接功能與奧沙利鉑抗腫瘤作用之間可能的機(jī)制。
　　方法：①Western blotting檢測睪丸細(xì)胞Cx43的表達(dá)水平。②免疫熒光法（Immunofluorescence Assay）檢測睪丸細(xì)胞膜

2、表面Cx43蛋白的表達(dá)。③細(xì)胞接種熒光示蹤法（Parachute Assay）檢測睪丸細(xì)胞間的熒光傳遞功能，即細(xì)胞GJ功能。④MTT法檢測高低密度接種細(xì)胞條件下，(0、5.0、10.0、20.0、40.0μM) oxaliplatin, OHP作用睪丸細(xì)胞24 h后，睪丸細(xì)胞（TM3、I-10）的存活率。⑤用不同密度接種細(xì)胞（1×104-8×104cells/ml）的方法，獲得生長融合細(xì)胞（細(xì)胞之間緊密接觸，有條件形成GJ）與生長未融合

3、細(xì)胞（細(xì)胞單個生長，無條件形成GJ），隨著密度的增加，生長融合程度增加，觀察融合程度對(oxaliplatin,OHP)細(xì)胞毒性的影響。⑥工具藥：GJ功能增強(qiáng)劑維甲酸（retinoic acid, RA）和GJ功能抑制劑油酸酰胺（oleamide）、18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid，18-α-GA）分別調(diào)控睪丸細(xì)胞GJ功能后，MTT法檢測OHP對睪丸細(xì)胞增殖抑制的變化，Annexin V/PI雙染方法

4、，檢測OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡的變化。⑦調(diào)控GJ功能后，Western blot檢測，OHP誘導(dǎo)的凋亡蛋白Bcl-2、Bax和抗增殖蛋白Prohibitin的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴采用western blotting檢測三種睪丸細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：睪丸正常細(xì)胞TM3、TM4中Cx43表達(dá)水平相對較高，睪丸腫瘤細(xì)胞I-10中Cx43表達(dá)水平較低。提示，睪丸腫瘤細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)降低。⑵細(xì)胞免疫熒光法（Immunof

5、luorescence）檢測睪丸細(xì)胞膜Cx43的表達(dá)。結(jié)果表明：睪丸正常細(xì)胞TM3、TM4中Cx43表達(dá)水平相對較高，睪丸腫瘤細(xì)胞I-10中Cx43表達(dá)水平較低。⑶MTT結(jié)果顯示(0、5.0、10.0、20.0、40.0μM) OHP均能抑制睪丸細(xì)胞生長，且隨著OHP濃度的增加，細(xì)胞的存活率降低；在TM3細(xì)胞中，高密度接種細(xì)胞時（生長融合，有GJ形成），OHP對細(xì)胞增殖抑制作用低于低密度接種細(xì)胞（生長未融合，無GJ形成）；在I-10細(xì)胞

6、中，高密度接種細(xì)胞時（生長融合，有GJ形成），OHP對細(xì)胞增殖抑制作用高于低密度接種細(xì)胞（生長未融合，無GJ形成）。⑷MTT結(jié)果顯示，在1×104-8×104 cells/ml的范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞密度的增加，10μM OHP作用24 h后，在TM3細(xì)胞中，OHP對細(xì)胞增殖抑制作用逐漸降低，而在I-10細(xì)胞中，OHP對細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。⑸細(xì)胞接種熒光示蹤法（Parachute Assay）實驗結(jié)果表明，10μM維甲酸(ratinoi

7、c acid，RA)處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞熒光傳遞功能顯著增強(qiáng)，TM3、I-10細(xì)胞熒光傳遞分別增強(qiáng)了40.36％±0.03、41.23%±0.04。⑹采用MTT法檢測10μM RA對OHP細(xì)胞增殖抑制的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），10μM RA增強(qiáng)GJ功能后，10μM OHP作用睪丸細(xì)胞24 h，TM3細(xì)胞存活率顯著增加（P<0.01）,I-10細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）;在低密度接種的

8、睪丸細(xì)胞（生長未融合，無GJ形成），10μM RA預(yù)處理組的細(xì)胞存活率與單用OHP組相比，無顯著變化（P>0.05）。⑺采用Annexin V/PI雙染檢測10μM RA對OHP誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞的早期凋亡的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），10μM RA增強(qiáng)GJ功能后，20μM OHP作用睪丸細(xì)胞12 h，OHP誘導(dǎo)的TM3細(xì)胞早期凋亡率降低（P<0.01），而OHP誘導(dǎo)的I-10細(xì)胞早期凋亡率增加（P<

9、0.01）。⑻細(xì)胞接種熒光示蹤法（Parachute Assay）實驗結(jié)果表明，10μM18-α-GA預(yù)處理睪丸細(xì)胞1 h，細(xì)胞GJ功能顯著降低，TM3、I-10細(xì)胞熒光傳遞分別降低了56.19%±0.03、61.64%±0.02。細(xì)胞接種熒光示蹤法（Parachute Assay）實驗結(jié)果表明，25μM oleamide預(yù)處理睪丸細(xì)胞1 h，細(xì)胞GJ功能顯著降低，TM3、I-10細(xì)胞熒光傳遞分別降低了61.21%±0.02、59.32

10、%±0.03。⑼采用MTT法檢測10μM18-α-GA對OHP細(xì)胞毒性的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），10μM18-α-GA抑制GJ功能后，10μM OHP作用睪丸細(xì)胞24 h，TM3細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，I-10細(xì)胞存活率顯著增加（P<0.01）;在低密度接種的睪丸細(xì)胞（生長未融合，無GJ形成），10μM18-α-GA預(yù)處理組的細(xì)胞存活率與單用OHP組相比，無顯著變化（P>0.05）

11、。采用MTT法檢測25μM oleamide對OHP細(xì)胞毒性的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），25μM oleamide抑制GJ功能后，10μM OHP作用睪丸細(xì)胞24 h，TM3細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，I-10細(xì)胞存活率顯著增加（P<0.01）;在低密度接種的睪丸細(xì)胞（生長未融合，無GJ形成），25μM oleamide預(yù)處理組的細(xì)胞存活率與單用OHP組相比，無顯著變化（P>0.05）。

12、⑽采用Annexin V/PI雙染檢測10μM18-α-GA對OHP誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞的早期凋亡的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），10μM18-α-GA抑制GJ功能后，20μM OHP處理睪丸細(xì)胞6 h，OHP誘導(dǎo)的TM3細(xì)胞早期凋亡率增加(P<0.01)，而OHP誘導(dǎo)的I-10細(xì)胞早期凋亡率降低(P<0.01)。采用Annexin V/PI雙染檢測25μM oleamide對OHP誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞的早期凋

13、亡的影響，實驗結(jié)果表明，在高密度接種的睪丸細(xì)胞（生長融合，有GJ形成），25μM oleamide抑制GJ功能后，20μM OHP處理睪丸細(xì)胞6 h，OHP誘導(dǎo)的TM3細(xì)胞早期凋亡率增加(P<0.01)，而OHP誘導(dǎo)的I-10細(xì)胞早期凋亡率降低(P<0.01)。⑾采用Western blot方法檢測，GJ對OHP誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。增強(qiáng)GJ功能，在TM3細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)增加(P

14、<0.01)；在I-10細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)降低(P<0.01)，抑制GJ功能，在TM3細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)降低(P<0.01)，在I-10細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)。采用Western blot方法檢測，GJ對OHP誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Prohibitin表達(dá)的影響。增強(qiáng)GJ功能，在TM3細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Prohibitin蛋白的表達(dá)降

15、低(P<0.01)，在I-10細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Prohibitin蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)；抑制GJ功能，在TM3細(xì)胞中，OHP誘導(dǎo)的Prohibitin蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)，在I-10細(xì)胞中， OHP誘導(dǎo)的Prohibitin蛋白的表達(dá)降低(P<0.01)。
　　結(jié)論：①睪丸正常細(xì)胞（TM3、 TM4）和睪丸腫瘤細(xì)胞（I-10）中表達(dá)不同水平的Cx43，正常細(xì)胞中Cx43表達(dá)高于腫瘤細(xì)胞。②GJ形成能夠顯著降