轉基因CHO復合仿生支架體外構建組織工程皮膚研究.pdf

1、目的：目前全球1.5億人患有2型糖尿病，每年大約有3％～6％糖尿病患者發(fā)生足部潰瘍，所以治療糖尿病潰瘍成為一個亟需解決的臨床問題。本研究選擇血小板衍化生長因子(platelet-derivedgrowthfactors)家族中活性最強的PDGF-BB作為目的蛋白，構建攜帶有增強型綠色熒光蛋白的PDGF-B真核表達載體，轉染真核細胞獲得穩(wěn)定表達PDGF-BB蛋白的細胞系，應用天然生物高分子水凝膠材料制備成三維細胞支架以負載轉基因種子細胞構

2、成組織工程皮膚，實現(xiàn)給藥時PDGF-BB與創(chuàng)面的連續(xù)接觸及保持創(chuàng)面的濕修復環(huán)境，為后期糖尿病大鼠皮膚潰瘍動物試驗奠定基礎。 方法：從人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)中分離總RNA；根據GenBank中報告的rhPDGF-BBcDNA序列，在上下游計物中加入BamHI和NheI的酶切位點序列；進行RT-PCR獲得rhPDGF-BBcDNA；構建克隆質粒pMD19-T

3、/rhPDGF-BB，經測序正確后，再將該目的片段與真核表達載體pSELECT-GFPzeo-MCS連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)菌落篩選得到含GFP報告基因的非融合型表達載體pSELECT-GFPzeo/rhPDGF-BB質粒；然后將其轉染入中國倉鼠卵巢細胞(chinesehamsterovarycell，CHO)，經Zeocin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達細胞系，應用細胞熒光及免疫細胞化學染色法鑒定，酶聯(lián)免疫吸附法(enzymeli

4、nkedimmunosorbentassay，EIISA)檢測目的蛋白的表達量，采用噻唑藍(thiazolylblue，MTT)法檢測其對NIH3T3細胞生長的作用。 選擇天然生物高分子材料殼聚糖經N-乙酰-L-半胱氨酸(n-acetyl-1-cysteinen，NAC)修飾后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，稱取10mg的樣品溶于1ml去離子水中生成水凝膠，對水凝膠的溶脹度及細胞毒性進行檢測；將該水凝膠負載轉基因

5、CHO細胞構成組織工程皮膚，并進行表征。 結果：RT-PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳顯示為一長約681bp的清晰條帶，將純化后的產物與pMD19-T克隆載體連接，陽性克隆質粒經BamHI和NheI的雙酶切可得到約681bp的條帶，測序證實與GenBank中的序列完全相符；將PDGF-B基因與表達載體pSELECT-GFPzeo-MCS連接，經雙酶切后得到約681bp的條帶，測序證實與GenBank中的序列完全相符，轉化E.col

6、iDH5α感受態(tài)菌篩選得到表達載體pSELECT-GFPzeo/rhPDGF-BB質粒；然后將其轉染入CHO細胞，經Zeocin抗生素篩選8周后獲得穩(wěn)定表達細胞系，綠色熒光持續(xù)表達，免疫細胞化學染色法顯示胞漿中存在大量陽性顆粒，ELISA法檢測目的蛋白的表達量為5.85μg/24h/106cells，MTT法檢測其對NIH3T3細胞生長具有明顯的促增殖的作用，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。 選擇分子量為300KDa、

7、脫乙酰度86％的殼聚糖經NAC改性后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，其穩(wěn)定性良好；水凝膠的溶脹度良好，MTT法檢測該水凝膠對細胞沒有毒性，不影響細胞增殖，組間存在差異(p<0.05)；將該水凝膠負載轉基因CHO細胞構成組織工程皮膚，掃描電鏡顯示其成互穿網絡結構，孔徑比較均一，細胞粘附良好。 結論：成功構建含有增強型綠色熒光蛋白的PDGF-BB真核表達載體，轉染真核細胞獲得穩(wěn)定表達PDGF-BB蛋白的細胞系，其分泌