表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚的初步研究.pdf

1、本研究應(yīng)用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細(xì)胞(ESC)，對(duì)分選的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定，并應(yīng)用分選的ESC作為種子細(xì)胞構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的表皮，為研究ESC的多向分化潛能和分化標(biāo)志的變化提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⒘η螳@得生物學(xué)性能更佳的組織工程皮膚，為臨床應(yīng)用提供更理想的生物修復(fù)材料。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，為研究組織工程皮膚種子細(xì)胞的生命軌跡和基因修飾打下基礎(chǔ)。 方法：對(duì)酶消化分離獲得的表皮細(xì)胞，

2、應(yīng)用Ⅳ型膠原快速粘附法進(jìn)行分選，并以限制性角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及克隆形成情況；選擇ESC相對(duì)特異性標(biāo)記分子β1整合素、角蛋白19(CK19)的單克隆抗體，用免疫組化法對(duì)分選后的各組細(xì)胞進(jìn)行鑒定；選擇HMB45、S-100特異表達(dá)作為標(biāo)記物，鑒定分選所得細(xì)胞及組織工程皮膚中黑色素細(xì)胞(MC)存在及含量；在培養(yǎng)的種子細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染GFP，觀察轉(zhuǎn)染的成功率，并應(yīng)用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，觀察組織工程皮膚

3、的培養(yǎng)過(guò)程中GFP的表達(dá)情況；對(duì)比研究ESC作為種子細(xì)胞與未分選的表皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚的組織結(jié)構(gòu)特性的差異。 結(jié)果：1.利用對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的高粘附力，可以初步篩選ESC；所分選的細(xì)胞體外培養(yǎng)可形成明顯的克??；15分鐘組，β1整合素、CK19雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞占28.50％。 2.Ⅳ型膠原快速粘附法分選的細(xì)胞中含有較多的MC，其在K-SFM培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長(zhǎng)并增殖，培養(yǎng)14天以后作為種子細(xì)胞所構(gòu)建的

4、組織工程皮膚中仍然含有較多的MC。 3.對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行了成功轉(zhuǎn)染GFP，陽(yáng)性率較高，構(gòu)建的組織工程皮膚中仍然可以觀察到GFP的表達(dá)。 4.經(jīng)分選的ESC構(gòu)建出來(lái)的組織工程皮膚，表皮生長(zhǎng)較對(duì)照組好，表皮顏色較深，組織切片見(jiàn)其表皮層更厚，表皮結(jié)構(gòu)更完善，表皮與真皮的結(jié)合更加緊密。 結(jié)論：1.Ⅳ型膠原快速粘附法是一種初步分選ESC的較好方法，可以得到含較高比例ESC的增殖活力好的表皮種子細(xì)胞；2.分選細(xì)胞中存在的MC可