金屬硫蛋白在肺鱗癌、腺癌中的表達及其臨床意義.pdf

1、目的：
　　 肺癌是常見的惡性腫瘤,目前國內外肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。盡管已經聯(lián)合應用手術、化療、放療和生物治療等各種手段,但其預后并無明顯改善,深入研究肺癌分子生物學特征對肺癌的早期診斷、治療及改善預后具有重要意義。金屬硫蛋白(metallothionein,MT)參與許多病理過程,包括金屬離子穩(wěn)態(tài)和解毒、保護氧化損傷、細胞增殖和凋亡、藥物和放射治療耐受和致癌的某些過程。在人體多種腫瘤,如乳腺癌、腎癌、鼻咽癌、卵巢

2、癌、睪丸癌、甲狀腺癌及膀胱癌等表達增加,但在某些腫瘤,如肝細胞癌(HCC),前列腺癌和大腸癌表達下調,結論不盡一致。MT在肺癌組織中的表達目前研究報道較少。我們應用免疫組化方法來檢測MT在肺鱗癌、腺癌的表達,并探討其與肺癌臨床病理因素間關系。
　　 材料與方法
　　 1、標本來源
　　 (1)石蠟切片收集中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科1999年1月至2009年3月手術切除的標本,包括66例原發(fā)灶及相應正常肺組織標

3、本,其中42例有配對的淋巴結轉移癌。所有病例術前均未行放療、化療,并且臨床資料完整。標本均經10％福爾馬林固定。常規(guī)處理后石蠟包埋。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1999年修訂的肺癌pTNM分期標準分為:1-2期26例,3-4期40例。年齡在34歲-82歲之間,男性37例,女性29例,中位年齡58歲,平均年齡55歲。肺鱗癌24例(高中分化鱗癌20例,低分化鱗癌4例),肺腺癌42例(高中分化腺癌38例,低分化腺癌4例)。癌旁正常肺組織取自同一

4、患者距腫塊邊緣5cm以上的正常肺組織,共15例。
　　 (2)肺癌細胞系二種分別為:肺腺癌細胞系A549、肺巨細胞癌細胞系BE1。
　　 2、試劑
　　 實驗試劑兔抗人MT單克隆抗體(FL-61,sc-11377)購自三塔公司,s-p試劑盒(kit-9701)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。
　　 3、實驗方法
　　 (1)細胞培養(yǎng)
　　 肺腺癌細胞系A549用DAAM培養(yǎng)基培養(yǎng)、BE1

5、細胞系用含10％的胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)后,于含0.5％Co2的37℃孵箱內培養(yǎng),0.25％胰蛋白酶消化、傳代。
　　 (2)免疫組織化學(s-p)法
　　 操作主要步驟:切片常規(guī)脫蠟、水化,3％過氧化氫去除內源性過氧化物酶,高溫高壓熱修復,檸檬酸鹽抗原修復液修復2min,蒸餾水沖洗5'×3遍、PBS沖洗5'x 3遍,非免疫動物血清室溫孵育10min,以封閉非特異性位點。傾去血清加一抗(1:100),4℃于冰箱孵育

6、過夜,蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍,加生物素標記的二抗,室溫孵育20min,PBS沖洗5'×3遍,加即用型廣譜試劑盒C液,室溫孵育20min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍,加即用型廣譜試劑盒D液,室溫25min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍,DAB顯色。蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。
　　 結果：評定標準 以肺癌細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達,評分參考文獻[1]

7、,結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分結果評定標準。MT陽性表達根據陽性細胞百分率和染色程度進行半定量結果判定:無陽性細胞記0分,陽性細胞百分率≤509％記1分,51％-75％記2分,≥75％記3分；胞漿和/或胞核基本不著色記0分,染色棕黃記1分,染色棕色記2分,染色褐色記3分。每張切片的陽性細胞百分率得分和染色程度得分兩項相加作為最后得分?？偡譃?-1分記為陰性(一),2-3分記為弱陽性(+),4-5分記為陽性(++),6

8、分以上記為強陽性(+++)；以陰性至弱陽性為低表達,陽性至強陽性為高表達。
　　 (3)肺癌細胞系的免疫化學染色(s-p)法:
　　 選擇生長狀態(tài)好的細胞一瓶,待細胞貼壁生長且伸開偽足,形態(tài)恢復正常時倒掉培養(yǎng)基,制作細胞爬片。PBS洗5'×3遍后,加入固定液固定20分鐘。PBS洗5'×3遍后,加入0.2％的Triton-100打孔,37℃孵育15分,PBS洗5'×3遍后加入A液,室溫孵育20分,PBS洗5'×3遍后加入B

9、液,室溫孵育20分,傾去血清不必沖洗,加稀釋的一抗(1:100),4℃冰箱過夜,PBS洗5'×3遍后加入C液,室溫孵育15分,PBS洗5'×3遍。加入D液,室溫孵育15分,PBS洗5'×3遍。DAB顯色(棕褐色反應產物代表抗原定位),蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。
　　 結果：
　　 1、MT在肺癌、癌旁正常組織的表達
　　 用s-p法進行免疫組織化學染色檢測6

10、6例鱗癌、腺癌MT的表達。可見肺癌旁正常組織僅見支氣管上皮細胞腔膜面MT表達(2/15,13％),肺泡上皮細胞陰性表達； MT在肺癌胞漿中54例陽性表達(54/66,81.81％),出現淺黃色至棕褐色顆粒樣物,其中鱗癌21例表達(見圖A)(21/24,87.5％)。腺癌33例表達(見圖B),(33/42,78.57％)。
　　 2、金屬硫蛋白基因表達與臨床病理參數的關系(見表1)
　　 對66例人肺鱗癌、腺癌組織中MT的

11、表達情況行X2檢驗。結果顯示MT’表達與年齡(p=0.479)、性別(p=0.079)、組織學分化(p=1.002)、組織學類型(p=0.366)無關,與分期有關(p=0.028),3、4期肺癌組織的陽性表達率顯著高于1、2期肺癌組織的陽性表達率。MT在肺癌組織的陽性表達率顯著高于肺癌旁組織的陽性表達率P=0.001。
　　 3、MT在肺癌中的表達與淋巴結轉移的關系(表2)
　　 在42例配對淋巴結轉移組中,原發(fā)癌MT的

12、陽性表達率為75.7％(28/37),轉移灶MT的表達率為100％(5/5),MT的表達與淋巴結轉移有相關性(p=0.002),原發(fā)灶與轉移灶相比較,MT在肺癌中的陽性強度沒有明顯改變。
　　 4、MT在肺癌細胞系A549、BE1的表達
　　 采用s-p法進行免疫組織化學染色檢測MT在肺癌細胞系A549、BE1表達,均為胞漿表達。
　　 結論：
　　 MT在肺鱗癌、腺癌中高表達,并與肺鱗癌、腺癌的TNM分