E2F因子誘騙阻斷對(duì)BOO后逼尿肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、逼尿肌細(xì)胞(DSMC)實(shí)質(zhì)是平滑肌細(xì)胞，是一種多能細(xì)胞，具備重塑能力，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。平滑肌細(xì)胞(SMC)廣泛分布于機(jī)體多個(gè)臟器，其形態(tài)和功能差異很大，與所在器官或組織其它細(xì)胞成分相互協(xié)作，分別適應(yīng)其生理功能。SMC一般分為增殖型和收縮型兩種表型。收縮型，見于成熟的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞通常呈梭形，具備較強(qiáng)的收縮功能；增殖型，見于生理發(fā)育期或病理過程中的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞形狀與成纖維細(xì)胞相似，增殖能力旺盛而收縮能力降低。SM-α-acti

2、n、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和cdk2激酶是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，SM-α-actin表達(dá)減少和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、cdk2激酶表達(dá)的增加標(biāo)志著細(xì)胞由收縮型向增殖型的轉(zhuǎn)化。 膀胱出口梗阻(Bladderoutletobstruction，BOO)是引起排尿困難、尿失禁、腎功能衰竭等臨床癥狀的最重要的原因，即使去除病因(如通過手術(shù)解除梗阻)后，仍然有約35-45％的患者膀胱功能不能恢復(fù)甚至繼續(xù)發(fā)生損害。我們前期的研究

3、發(fā)現(xiàn)，膀胱功能不能恢復(fù)的微觀結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是平滑肌細(xì)胞(逼尿肌細(xì)胞)在周期性的超過生理負(fù)荷的張力作用下的重塑(表型轉(zhuǎn)化)，即由正常的收縮型表型逐漸轉(zhuǎn)化為增殖表型。 而在細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)錄因子E2F發(fā)揮重要作用：正常時(shí)轉(zhuǎn)錄因子E2F在G1末期與具備特異結(jié)合位點(diǎn)的順式元件結(jié)合，啟動(dòng)其下游c-myc、PCNA、cdk2激酶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖。轉(zhuǎn)錄因子誘騙(Transcriptionalfactordecoy，TFD)

4、即人工合成與DNA分子順式元件具有一致序列的雙鏈寡脫氧核苷酸，將它轉(zhuǎn)染到活體細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子順式元件特定的區(qū)域結(jié)合，從而抑制相關(guān)基因的表達(dá)。 因此，我們從以下三個(gè)層次深入研究。第一，根據(jù)BOO對(duì)膀胱逼尿肌細(xì)胞的尿動(dòng)力學(xué)致傷機(jī)理，通過對(duì)體外培養(yǎng)的逼尿肌細(xì)胞施加周期性超負(fù)荷牽拉刺激作用，建立細(xì)胞水平的BOO生物力學(xué)模型，并在此基礎(chǔ)上考察細(xì)胞在張力負(fù)荷下逐漸發(fā)生的表型轉(zhuǎn)化(細(xì)胞重塑)；第二，先將E2

5、F誘騙寡核苷酸(E2FDecoyODN)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，后實(shí)施牽拉，探討E2FDecoy對(duì)張力負(fù)荷下DSMC表型轉(zhuǎn)化的預(yù)防作用；第三，先實(shí)施牽拉，后轉(zhuǎn)染E2FDecoyODN，探討E2FDecoy對(duì)DSMC增殖表型的逆轉(zhuǎn)作用，即能否將增殖表型的細(xì)胞恢復(fù)為初始的收縮表型。 主要的結(jié)果、結(jié)論如下： 1.建立了細(xì)胞水平的BOO模型。在彈性底部的培養(yǎng)皿上成功培養(yǎng)大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞，對(duì)其施加周期性張力負(fù)荷作用，建立起一種排除了膀胱神經(jīng)

6、、體液等因素的干擾，能反映單個(gè)逼尿肌細(xì)胞自身功能改變的全新的BOO實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2.張力負(fù)荷使逼尿肌細(xì)胞由收縮型逐漸轉(zhuǎn)化為增殖型。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)張力負(fù)荷使細(xì)胞增殖活性顯著增加。免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)張力超負(fù)荷使收縮型標(biāo)志α-actin表達(dá)降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生紊亂。RT-PCR和Western-blotting發(fā)現(xiàn)，張力超負(fù)荷使細(xì)胞的增殖標(biāo)志PCNAmRNA表達(dá)和PCNA、cdk2kinase的蛋白表達(dá)顯著性增加。 3.E2F誘

7、騙能有效預(yù)防正常逼尿肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。預(yù)先轉(zhuǎn)染E2FdecoyODN，后施加張力超負(fù)荷，MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖性明顯降低，RT-PCR和Western-blotting發(fā)現(xiàn)PCNAmRNA表達(dá)和PCNA、cdk2kinase的蛋白表達(dá)均顯著性下降。 4.E2F誘騙對(duì)逆轉(zhuǎn)逼尿肌細(xì)胞增殖表型有一定作用。先施加張力超負(fù)荷，后轉(zhuǎn)染E2FdecoyODN，MTT實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖性明顯降低，Western-blotting未發(fā)現(xiàn)PCNA和