花刺參粘多糖及復(fù)方對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡、表型轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的:血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)或10％胎牛血清(FBS)刺激血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)，造成增殖、抗凋亡模型，觀察花刺參粘多糖及其復(fù)方制劑對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠VSMC增殖、凋亡及VSMC表型轉(zhuǎn)化的影響。 方法:用組織塊法原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠胸主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞，傳代細(xì)胞(5-7代)經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)24h，0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液血清饑餓(使其同步化于G0/G1期)24h后，隨機(jī)分為對(duì)照組、

2、模型組、花刺參粘多糖(ST)組、復(fù)方花刺參粘多糖(復(fù)方ST)組、辛伐他汀組五組。實(shí)驗(yàn)分為PDGF和FBS兩種刺激模型，對(duì)照組只加含0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液。PDGF模型組：0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液+PDGF-BB(終濃度達(dá)到20ng/m1)，F(xiàn)BS模型組：0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液+10％FBS；ST組在PDGF或FBS模型組的基礎(chǔ)上加入ST(大劑量20mg/ml、小劑量5mg/ml)；復(fù)方ST組在PDGF或FBS模型組

3、的基礎(chǔ)上加復(fù)方ST(大、中、小劑量組分別含中藥提取物終濃度為60mg/ml、30mg/ml、10mg/m1)；辛伐他汀組在PDGF或FBS模型組的基礎(chǔ)上加辛伐他汀10umol/L。作用24h后，1)MTT法酶標(biāo)儀觀測(cè)各組細(xì)胞吸光度值(OD值)。2)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察各組細(xì)胞周期變化；3)用TUNEL、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)兩種方法觀察藥物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響；4)RT-PCR半定量測(cè)定細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和骨橋蛋白mRNA表達(dá)情況。實(shí)

4、驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果1.ST及復(fù)方ST對(duì)VSMC增殖的影響(MTT)(1)用PDGF刺激增殖模型中，ST大劑量組(0.187±0.017)、復(fù)方ST大劑量組(0.155±0.007)、中劑量組(0.292±0.065)OD值顯著低于模型組(0.406±0.003)，P＜0.01；此三組OD值與辛伐他汀組(0.347±0.024)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (2)用FBS刺激的增殖模型中，復(fù)方S

5、T大、中、小劑量組(OD值分別為0.286±0.015、0.408±0.021、0.445±0.020)、辛伐他汀組(0.419±0.011)、ST大劑量組(0.369±0.019)OD值均顯著低于模型組(0.484±0.034)，P＜0.05，且復(fù)方ST各組OD值呈劑量依賴性降低。復(fù)方ST大劑量組、ST大劑量組OD值顯著低于辛伐他汀組，P＜0.01。 2.ST及復(fù)方ST對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響(1)在PDGF模型中，復(fù)方ST組

6、(90.3％±6.9％)、辛伐他汀組(87.5％±6.1％)、ST組(88.1％±5.3％)G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于模型組(77.4％±5.7％)，P＜0.05，S期細(xì)胞比例比模型組明顯減少(分別為6.3％±6.8％，6.7％±4.0％，6.3％±3.3％vs14.8％±2.4％)；G0/G1期、S期細(xì)胞比例在各藥物組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (2)在FBS刺激模型中，G0/G1期細(xì)胞比例復(fù)方ST組、辛伐他汀組、ST組顯著高于

7、模型組(分別為69.9％±0.1％、71.8％±2.4％、75.8％±1.8％vs54.7％±12.7％)，P＜0.05；各藥物組間G0/G1期細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；辛伐他汀組、ST組S期細(xì)胞比例較模型組減少(14.1％±6.7％、13.9％±1.8％vs32.5％±10.9％，P＜0.05)，而復(fù)方ST組(19.6％±2.8％)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.ST及復(fù)方ST對(duì)VSMC細(xì)胞凋亡的影響(1)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果在PD

8、GF模型中，復(fù)方ST組(26.8％±10.8％)、辛伐他汀組(27.0％±9.1％)、ST組(22.6％±2.3％)細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組(8.6％±2.3％)，P＜0.05。復(fù)方ST組、ST組凋亡率與辛伐他汀組相比皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 在FBS模型中，復(fù)方ST組(18.62％±2.46％)、辛伐他汀組(26.59％±2.30％)、ST組(13.51％±2.75％)細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組(2.84％±1.44％)，P＜0.01。

9、復(fù)方ST組、ST組凋亡率與辛伐他汀組相比明顯降低(P＜0.01)。 (2)TUNEL檢測(cè)結(jié)果在PDGF模型中，復(fù)方ST組(14.9％±0.90～)、辛伐他汀組(9.7％±1.01％)、ST組(10.1％±0.90％)凋亡細(xì)胞比例比模型組(2.7％±0.39％)顯著增高，P＜0.01。復(fù)方ST組凋亡細(xì)胞比例顯著高于辛伐他汀組(P＜0.01)。 在FBS模型中，，復(fù)方ST組(7.8％±2.03％)、辛伐他汀組(11.1％±1

10、.29％)、ST組(8.6％±1.13％)凋亡細(xì)胞比例與模型組(2.9％±1.05％)相比顯著增高，P＜0.01。與辛伐他汀組相比，復(fù)方ST組、ST組凋亡細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05)。 4.ST及復(fù)方ST對(duì)VSMC骨橋蛋白mRNA表達(dá)的影響(1)在PDGF模型中，復(fù)方ST組、ST組細(xì)胞骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P＜0.01)；與辛伐他汀組相比，復(fù)方ST組、ST組細(xì)胞骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05

11、)。 (2)在FBS模型中，復(fù)方ST組、ST組細(xì)胞骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組相比，P＜0.05。與辛伐他汀組相比，復(fù)方ST組細(xì)胞骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平降低，P＜0.05，而ST組與辛伐他汀組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5.ST及復(fù)方ST對(duì)VSMCα-SMAmRNA表達(dá)的影響在PDGF或10％FBS刺激后，α-SMAmRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；與模型組相比，ST、復(fù)方ST、辛伐他汀對(duì)細(xì)胞α-SMAmRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、差異。 結(jié)論1.復(fù)方ST及ST在體外能有效抑制PDGF-BB或10％FBS刺激的大鼠VSMC細(xì)胞增殖。 2.復(fù)方ST及ST可顯著地抑制PDGF-BB或10％FBS對(duì)VSMC的抗凋亡作用，促進(jìn)體外VSMC的凋亡。 3.復(fù)方ST及ST有效逆轉(zhuǎn)PDGF和10％FBS刺激的細(xì)胞骨橋蛋白mRNA高表達(dá)，提示復(fù)方ST及ST可能具有抑制VSMC遷移及抑制細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變的作用。 4.復(fù)方ST及ST對(duì)VSMC細(xì)胞