山楂酸對人肺腺癌A549細胞的抑制作用以及基于MicroRNA調(diào)控的分子機制研究.pdf

1、肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位。目前針對肺癌的治療主要包括手術、放療、化療、靶向治療等方法，多數(shù)肺癌患者在其病程的不同時期均需要接受化療治療。臨床常用的化療藥物雖然抗腫瘤作用確切、療效顯著，但有骨髓抑制、消化道反應等毒副作用及腫瘤耐藥等問題，嚴重影響患者對藥物的耐受性和治療效果，所以迄今為止臨床化療的效果仍不能令人滿意，為肺癌治療上的難點。
　　近年來從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分如:三尖杉堿

2、、紫杉醇等抗腫瘤藥物，已經(jīng)成為臨床上腫瘤治療的常用藥物。從植物中提取的天然化合物因其廣泛的生物活性、低毒性和較少的副作用而備受關注。山楂酸(Maslinic acid)是從油橄欖、紅棗、枇杷葉、山楂等植物中分離得到的一個三萜類天然有機化合物，分子式C30H48O4，分子量為472.70。油橄欖中富含山楂酸，橄欖油是地中海沿岸各國人民傳統(tǒng)食用油，具有非常好的營養(yǎng)保健作用，此外還被廣泛應用于美容保健。地中海沿岸居民的體質(zhì)強壯、壽命長，那里的

3、心血管病、癌癥、老年癡呆癥，三大疾病的發(fā)病率非常低。在我國，山楂酸多從枇杷葉中提取，枇杷廣泛分布于中南及陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣、四川、貴州、云南等地，全年皆可采收。山楂酸對人體的高安全性及多種生物活性，引起了人們極大的研究興趣。近年來的研究表明，山楂酸具有諸多藥理活性，如抗癌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗菌、抗糖尿病以及血管舒張、降膽固醇等作用。國內(nèi)對山楂酸抗腫瘤相關研究較少，近年國外研究發(fā)現(xiàn)，山楂酸對人結腸癌HT2

4、9細胞、人前列腺癌DU145細胞、小鼠黑色素瘤細胞等有較強的抗腫瘤活性，其中部分作用機制與誘導腫瘤細胞凋亡相關。目前為止，山楂酸對肺癌的影響國內(nèi)外尚未見報道。顯然山楂酸是一個非常有研究價值的天然產(chǎn)物，它可以作為抗腫瘤藥物深入研究，具有廣闊的應用前景。
　　MicroRNA(miRNA)是19～24nt的非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于哺乳動物細胞中，在基因的轉錄和翻譯、細胞分化和個體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等生命活動中發(fā)揮重要的調(diào)控

5、作用。近年來的研究證明miRNA的改變在人類腫瘤中廣泛存在，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用。miRNA直接或間接調(diào)控癌基因或抑癌基因表達，是近年來腫瘤研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)與肺癌相關的miRNA有Let-7、miR-17-92、miR-21、miR-155、miR-200c、miR-126、miR-34、miR-31等幾十種。它們在肺癌中表達升高或降低，調(diào)節(jié)轉錄后翻譯，促進或抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。通過分子生物學方法將肺癌中某些

6、特定miRNA的表達增強或抑制后，可以抑制肺癌的增殖，起到治療肺癌的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物也可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞中miRNA的表達升高或降低，進而通過調(diào)節(jié)轉錄后翻譯發(fā)揮其抗腫瘤作用。miRNA可以作為藥物治療腫瘤的新靶點，在腫瘤新藥的開發(fā)、藥物抗腫瘤機制研究中發(fā)揮重要作用。
　　本實驗研究山楂酸對肺癌A549細胞的抑制作用以及基于microRNA調(diào)控的分子機制，為深入研究山楂酸抗腫瘤機制提供實驗基礎，為應用于臨床治療肺癌提供理論

7、依據(jù)。
　　實驗材料與方法:
　　一、山楂酸對肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響的研究采用四甲基偶氮噻藍(MTT)法檢測山楂酸對A549細胞增殖的影響;采用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡;熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)變化;采用Western blotting方法檢測山楂酸對凋亡相關蛋白Caspase-3，9的表達的影響。
　　二、山楂酸與順鉑合用對肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響的研究
　　采用四

8、甲基偶氮噻藍(MTT)法檢測山楂酸、順鉑單獨應用以及合用對A549細胞增殖的影響;采用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測山楂酸、順鉑單獨應2用以及合用對細胞凋亡的影響;熒光顯微鏡觀察山楂酸、順鉑單獨應用以及合用對細胞核的形態(tài)變化的影響;采用Western blotting方法檢測山楂酸、順鉑單獨應用以及合用對凋亡相關蛋白XIAP、Survivin的表達的影響。
　　三、MicroRNA在山楂酸對肺癌A549細胞抑制作用中的

9、研究
　　利用AFFX miRNA表達譜芯片檢測山楂酸作用前后A549細胞中miRNA表達差異，篩選出山楂酸抑制A549細胞作用的靶miRNA，預測細胞增殖相關靶基因及細胞凋亡相關靶基因。
　　實驗結果:
　　一、山楂酸對肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響
　　MTT法檢測結果顯示隨著濃度的加大，山楂酸對A549細胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量效應關系，與對照組相比差異具有顯著性。流式細胞檢測細胞凋亡率表

10、明隨著山楂酸濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加，與對照組相比差異具有顯著性。熒光電子顯微鏡觀察山楂酸作用后的細胞中可見染色體邊集、核碎裂等典型的凋亡改變，而對照組沒有相應的變化。經(jīng)過不同濃度山楂酸處理A549細胞24小時后，Western blotting方法檢測結果顯示，隨著山楂酸濃度的不斷增加，Caspase-3，9蛋白表達水平逐漸降低，CleavedCaspase-3，9蛋白表達水平逐漸增加。
　　二、山楂酸

11、與順鉑合用對肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響的研究
　　MTT法檢測結果，山楂酸、順鉑單獨應用均可抑制A549細胞的增殖，二者合用明顯增強對A549細胞的增殖抑制效應，與對照組相比差異具有顯著性。流式細胞檢測細胞凋亡率表明山楂酸、順鉑單獨應用均可引起A549細胞凋亡，二者合用明顯增加A549細胞凋亡率，與對照組相比差異具有顯著性。熒光電子顯微鏡觀察山楂酸、順鉑單獨作用A549細胞后細胞核形態(tài)均發(fā)生顯著性改變，呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核固縮

12、、核片斷化，二者合用時凋亡細胞明顯增多，核碎裂明顯，細胞大片脫落形成細胞脫失區(qū)。Western blotting方法檢測結果顯示，山楂酸、順鉑單獨應用均可降低XIAP、Survivin蛋白的表達，二者合用可使XIAP、Survivin蛋白的表達明顯降低。
　　三、MicroRNA在山楂酸抑制A549細胞中的作用
　　AFFX miRNA表達譜芯片檢測山楂酸作用前后A549細胞中miRNA表達差異，篩選出山楂酸抑制A549細胞

13、的靶miRNA，其中59個miRNA表達顯著差異（大于10倍以上改變），23個miRNA表達上調(diào)，36個miRNA表達下調(diào)。生物信息學分析預測，由上述miRNA調(diào)控的細胞增殖相關靶蛋白400余個，細胞凋亡相關靶蛋白300余個，其中XIAP是miR-630下游調(diào)控的靶蛋白。
　　結論:
　　1、山楂酸可以抑制肺癌A549細胞的增殖，這種抑制作用具有濃度依賴性;山楂酸抑制肺癌A549細胞的增殖是通過誘導其凋亡來實現(xiàn)的，凋亡通路之

14、一可能是線粒體凋亡通路。
　　2、山楂酸、順鉑單獨應用均對肺癌A549細胞有增殖抑制效應及誘導凋亡作用，二者合用有協(xié)同作用;山楂酸、順鉑單獨應用均可下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin，二者合用可增強對凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin的下調(diào)作用。
　　3、59個miRNA參與了山楂酸對A549細胞的抑制作用，其中23個miRNA表達上調(diào)，36個miRNA表達下調(diào)。生物信息學分析預測，由上述miRNA調(diào)控的細胞增殖