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文檔簡介
1、胃癌占消化道腫瘤死亡人數(shù)的一半和各種惡性腫瘤死亡總數(shù)的1/5,死亡原因在于術(shù)后患者容易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。術(shù)中、術(shù)后徹底消滅腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞和微小癌灶是預(yù)防復(fù)發(fā),提高生存率的關(guān)鍵。腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧⒒熤苯幼饔糜诟骨粌?nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移部位,對預(yù)防胃腸道惡性腫瘤根治術(shù)后復(fù)發(fā)有一定作用。目前,術(shù)中、術(shù)后腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧⒒熞阎饾u成為大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)的目前治療進(jìn)展期胃腸道腫瘤的有效方法。吡柔比星(Pirarubicin,THP)日前主要應(yīng)用于乳腺癌、小細(xì)胞
2、肺癌、白血病和淋巴瘤的全身治療以及膀胱癌腔內(nèi)灌注,但在腹腔內(nèi)灌注溫?zé)峄煼矫娴难芯亢苌?,特別是在術(shù)中使用THP進(jìn)行溫?zé)峄煼矫娴难芯扛?。本課題擬研究吡柔比星對胃癌細(xì)胞、組織的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和作用機(jī)制以及對裸鼠生存的影響。以了解吡柔比星在腹腔灌注化療中的應(yīng)用可能,指導(dǎo)臨床應(yīng)用。 目的:研究吡柔比星和溫?zé)釁f(xié)同對胃癌細(xì)胞和組織的體外作用,以及對胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲的影響,探討吡柔比星和溫?zé)釁f(xié)同協(xié)同作用機(jī)制及對裸鼠生存率的影響。
3、 方法: 第一章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌細(xì)胞的體外作用研究。(1)人類胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,使用THP、順鉑(DDP)、絲裂霉素(MMC)和氟尿嘧啶(5FU)處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。THP濃度設(shè)定為25μg/ml、32μg/ml和40μg/ml,摸索THP腹腔灌注化療的最佳作用濃度;(2)在確定合適濃度的THP后,通過37.5℃、39℃、41℃、43℃和45℃五個溫度梯度處理,MTS-PMS比色法檢測細(xì)胞活性
4、,研究THP的熱效應(yīng);(3)處理溫度設(shè)定為43℃和45℃,43℃處理時間為30min、60min、90min和120min;45℃處理時間30min、45min和60min;(4)在37℃和43℃加或不加32μg/mlTHP作用后,測定MGC-803細(xì)胞的生長曲線并計算細(xì)胞倍增時間,研究THP作用的時間效應(yīng);(5)MGC-803細(xì)胞經(jīng)37℃、41℃、43℃、37℃+THP(32μg/ml)、41℃+THP(32μg/ml)、43℃+TH
5、P(32μg/ml)處理60min后,使用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度,Cellquest分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析;(6)AnnexinV-FITC方法測定細(xì)胞凋亡。 第二章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用研究。(1)對數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞經(jīng)37℃或43℃,32μg/mlTHP處理60min后,做軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),評價溫?zé)峄焻f(xié)同處理對胃癌細(xì)胞的克隆增殖抑制作用;(2)使用流式細(xì)胞儀檢測不同處理組的MGC-803細(xì)
6、胞PCNA核蛋白的表達(dá)水平;(3)RT-PCR擴(kuò)增分析不同處理組的MGC-803細(xì)胞CyclinEmRNA表達(dá)水平;(4)Transwell小室模型測定37℃或43℃,32μg/mlTHP處理60min后的MGC-803細(xì)胞侵襲潛能。 第三章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌組織的體外作用研究。(1)收集病理學(xué)確診的胃癌手術(shù)切除組織36例,建立人胃癌組織體外立體培養(yǎng)作用模型;(2)分別在37℃和42℃兩種溫度條件下研究THP、DDP、MM
7、C和5FU的抑瘤效果。胃癌組織塊放入預(yù)加培養(yǎng)基培養(yǎng)板中,培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜,第二天加入含有藥物的培養(yǎng)基,42℃處理組42℃培養(yǎng)1h,37℃組則不需要。THP濃度設(shè)定為32μg/ml,DDP處理濃度為50μg/ml,MMC濃度為15μg/ml,氟尿嘧啶為350μg/ml,利用MTS-PMS比色法檢測細(xì)胞活性;(3)組織形態(tài)學(xué)HE染色研究評價藥物對胃癌組織的殺傷效應(yīng)。 第四章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同的動物實(shí)驗(yàn)研究。對數(shù)生長期MGC-80
8、3細(xì)胞在37℃或43℃,32μg/mlTHP處理60min后注射裸鼠腹腔。記錄腹水出現(xiàn)時間,繪制各處理組存活曲線。計算中位生存時間,分析溫?zé)峒盎熕幬锾幚韺β闶螽a(chǎn)生腹水和生存率的影響。 結(jié)果: 第一章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌細(xì)胞的體外作用研究。THP對MGC-803細(xì)胞的殺傷具有較強(qiáng)的溫度依賴關(guān)系,其作用在39-45℃溫度區(qū)間內(nèi)隨溫度升高而加強(qiáng),在45℃達(dá)到最大;THP的殺傷作用具有劑量和時間依賴關(guān)系,隨藥物濃度增加或處
9、理時間的延長,藥物殺傷作用均增強(qiáng);43℃以上THP32μg/ml和40μg/ml兩濃度組殺傷作用接近并進(jìn)入平臺期;熱殺傷效應(yīng)在高于43℃時效應(yīng)明顯;在確定溫度條件下,THP對MGC-803細(xì)胞的殺傷作用具有時間依賴關(guān)系,隨處理時間的延長,藥物殺傷作用增強(qiáng);其中,43℃時藥物作用在90min后逐漸進(jìn)入平臺期;45℃時THP作用60min殺傷作用強(qiáng)于43℃作用90min;THP在確定溫度的各個時點(diǎn)的細(xì)胞殺傷作用均強(qiáng)于順鉑;THP和溫?zé)崽幚砗?/p>
10、,細(xì)胞生長速度減慢,細(xì)胞倍增時間延長(P<0.01);MGC-803細(xì)胞經(jīng)43℃THP作用10min后,細(xì)胞增殖能力下降,未加藥對照組、單純THP組和43℃+THP組的MGC-803細(xì)胞倍增時間從20.4±3.0h減慢至54.3±7.0h和65.5±9.6h;細(xì)胞周期研究表明,THP和溫?zé)釁f(xié)同處理對處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞均具有良好的殺傷作用,導(dǎo)致處于G2/M期的細(xì)胞比例減少,處于S期的細(xì)胞比例增多,并出現(xiàn)大量的壞死和調(diào)亡,與加溫或加藥處理
11、組比較均有顯著差異(P<0.05),并出現(xiàn)大量的壞死和凋亡;細(xì)胞凋亡比例隨溫度升高而增加,THP溫?zé)釁f(xié)同處理組為35.6%±3.9,與單純加溫或單純加藥組相比差異顯著(P<0.01)。 第二章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用研究。THP與溫?zé)釁f(xié)同處理能夠顯著抑制MGC-803細(xì)胞的克隆形成能力(P值<0.01)。37℃對照組集落數(shù)為126±12.2個/孔,43℃處理組為92±10.7個/孔,37℃+THP處理組為36
12、±9.6個/孔,43℃+THP處理組為9.67±4.2個/孔;43℃、37℃+THP和43℃+THP處理組克隆形成抑制率分別為27.0%、71.4%和92.3%;能夠顯著下調(diào)PCNA細(xì)胞增殖核蛋白的表達(dá)水平和CyclinEmRNA表達(dá)水平,從而減少腫瘤復(fù)發(fā)潛能;37℃對照組細(xì)胞表達(dá)PCNA陽性率和CyclinEmRNA水平分別為93.7±4%、1.243±0.072,43℃處理組為62.3±2.1%、1.256±0.088,37℃+TH
13、P處理組為29.7±1.5%、0.848±0.052,43℃+THP處理組為3±1%、0.056±0.023(P值均<0.01);Transwell小室侵襲研究表明,THP與溫?zé)釁f(xié)同處理能夠顯著減少侵襲細(xì)胞數(shù)量(P值<0.01),37℃對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為92.0±12.1個/視野,43℃處理組為85.7±10.0個/視野,37℃+THP處理組為45.7±8.3個/視野,43℃+THP處理組為10±4個/視野;3個處理組侵襲抑制率分別為6
14、.5%、50.0%和89.1%,統(tǒng)計學(xué)分析表明P均<0.01,顯著地抑制了MGC-803細(xì)胞的侵襲潛能。 第三章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同對胃癌組織的體外作用研究。DDP、MMC和THP對胃癌組織的殺傷均具有較強(qiáng)的溫?zé)釁f(xié)同關(guān)系(P=0.000);其42℃作用均較37℃顯著增強(qiáng)(P<0.05);其中THP在37℃和42℃均體現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷效應(yīng);THP單獨(dú)處理和溫?zé)釁f(xié)同處理均具有較強(qiáng)的抑制作用,和其它3種藥物抑制率比較具有顯著性差異(P<0
15、.05);HE染色表明,藥物和溫?zé)釁f(xié)同對腫瘤組織作用均可造成腫瘤細(xì)胞變性,壞死,細(xì)胞核固縮,并有大量核碎片化現(xiàn)象;THP和溫?zé)崽幚砗螅赴┙M織大部崩解,細(xì)胞變性壞死,細(xì)胞核固縮,胞漿散失;臨床因素分析表明,THP和溫?zé)釁f(xié)同處理效果和胃癌病例的組織分級有關(guān)(P=0.000),而與年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小和術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平無關(guān)(P>0.05)。 第四章吡柔比星與溫?zé)釁f(xié)同的動物實(shí)驗(yàn)研究。吡柔比星和溫?zé)釁f(xié)同能延遲裸鼠產(chǎn)生
16、腹水的時間,提高裸鼠的生存率。正常37℃培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞情況下裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為7.2天,43℃處理后裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為9.3天,使用THP處理后裸鼠腹水平均出現(xiàn)時間為21.3天,溫?zé)釁f(xié)同組(43℃+THP)的大部分裸鼠在第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時仍然沒有出現(xiàn)腹水。THP處理組腹水生成時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于對照組和單純溫?zé)峤M(P=0.00)。經(jīng)THP+43℃處理MGC-803細(xì)胞后,MGC-803細(xì)胞接種裸鼠,全部裸鼠存活;而單純THP處理后
17、至實(shí)驗(yàn)截止時有3只裸鼠未死亡;中位生存時間為31.0±2.37天;未經(jīng)THP處理過的MGC-803細(xì)胞接種裸鼠后,至第6周結(jié)束時裸鼠全部死亡;中午生存時間19.0±1.05天。 結(jié)論:THP對胃癌細(xì)胞具有良好的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和腫瘤殺傷效果。THP與溫?zé)釁f(xié)同處理能夠通過顯著下調(diào)胃癌細(xì)胞PCNA和CyclinE表達(dá)水平,同時抑制其侵襲能力,THP對胃癌組織具有良好的溫?zé)釁f(xié)同效應(yīng)和腫瘤殺傷效果,可以減少裸鼠腹水的生成并提高裸鼠的生存率。
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