抑制Aurora-A激酶協(xié)同DNA損傷化療藥物多柔比星導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的重大疾病之一。由于腫瘤起病隱襲，病程較快，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)傳統(tǒng)的手術(shù)及化學(xué)治療效果均有限。從總體來(lái)說(shuō)，當(dāng)前采用DNA損傷藥物進(jìn)行腫瘤的化療仍由于治療相關(guān)性死亡，如對(duì)心臟的毒性、骨髓抑制等，或由于基因異常表達(dá)導(dǎo)致對(duì)藥物的敏感性降低而失敗。因此，尋找新的有效的靶點(diǎn)分子，從病因?qū)W上治療腫瘤成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，而靶向小分子抑制劑與傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用來(lái)治療這一復(fù)雜性疾病，將為腫瘤治療開(kāi)辟新的領(lǐng)域。

2、 分子生物學(xué)的迅速發(fā)展使人們對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，針對(duì)其中起關(guān)鍵作用的分子靶點(diǎn)研制的小分子抑制劑愈來(lái)愈受到人們的重視。近期發(fā)現(xiàn)的有絲分裂激酶Aurora—A（Aur—A）在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂中起關(guān)鍵作用，更重要的是在急性髓系白血病和許多部位的實(shí)體瘤，如乳腺癌、肝癌、食管癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌及膀胱癌中，均發(fā)現(xiàn)Aur—A的基因擴(kuò)增、突變或蛋白高表達(dá)。初步臨床研究證實(shí)，Aur—A可作為一項(xiàng)與腫瘤發(fā)生、惡化密切相關(guān)

3、的分子標(biāo)記。新近的研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷藥物可抑制Aur—A的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯，并可引起染色體分離的紊亂；高表達(dá)Aur—A可使細(xì)胞逃逸細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)控而繼續(xù)存活，從而對(duì)腫瘤治療藥物產(chǎn)生抵抗，為臨床上提供了一個(gè)有效的靶點(diǎn)。本研究將深入探討Aur—A作為DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)蛋白的重要性，進(jìn)而探索靶向抑制Aur—A基因聯(lián)合DNA損傷化療藥物治療腫瘤的生物學(xué)效果及其分子機(jī)制，為小分子抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合作用治療難治復(fù)發(fā)性腫瘤提供理論與實(shí)

4、踐依據(jù)。為此，本研究作了以下探討： 我們前期的工作，采用非洲蟾蜍卵模型證明了Aur—A是DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)一個(gè)重要蛋白；在此基礎(chǔ)上，我們采用人類(lèi)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，以揭示在腫瘤細(xì)胞中DNA損傷藥物與Aur—A之間的關(guān)系，為靶向Aur—A激酶的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。進(jìn)而，我們采用臨床標(biāo)本利用免疫組化的方法對(duì)腫瘤組織中Aur—A的表達(dá)進(jìn)行研究，并分析其與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分級(jí)、臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移等的

5、關(guān)系，以揭示Aur—A作為腫瘤治療靶點(diǎn)的依據(jù)。同時(shí)，我們嘗試運(yùn)用Aur—A激酶的小分子抑制劑VX—680作用于胃癌細(xì)胞株，采用Western blot、免疫熒光、RNAi、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)研究其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響并闡明其中相關(guān)的信號(hào)通路，以明確該小分子抑制劑靶向治療腫瘤的特異性和高效性。最后，我們將通過(guò)VX—680與臨床上常用的DNA損傷藥物多柔比星進(jìn)行聯(lián)合作用，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的協(xié)同作用，評(píng)價(jià)其治療腫瘤的臨床潛在效力，并

6、明確相關(guān)的分子機(jī)制。 本課題研究的結(jié)果及意義： 1.利用細(xì)胞模型，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞周期激酶Aur—A是DNA損傷作用檢測(cè)點(diǎn)的重要蛋白，抑制Aur—A可增強(qiáng)DNA損傷化療藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，提示Aur—A過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致該檢測(cè)點(diǎn)的失活，從而使臨床上DNA損傷化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用降低。該研究為臨床提供了一個(gè)有效的靶點(diǎn)，為靶向Aur—A的抗腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.利用臨床標(biāo)本我們分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中存在A(yíng)

7、ur—A的高表達(dá)，并且該高表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)，進(jìn)一步提示了胃癌中Aur—A可能是臨床上DNA損傷化療藥物敏感性下降，腫瘤化療治愈率低的原因之一，針對(duì)Aur—A設(shè)計(jì)相應(yīng)的小分子抑制劑將為臨床腫瘤治療開(kāi)辟新的方向。 3.Aur—A小分子抑制劑VX—680對(duì)Aur—A激酶活性具有抑制作用，其能劑量依賴(lài)性的抑制胃癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，顯示出該新型小分子抑制劑針對(duì)胃癌細(xì)胞的強(qiáng)大細(xì)胞毒性作用，并且此作用與激活Caspase通路，下

8、調(diào)抗凋亡因子Bcl—2有關(guān)。通過(guò)RNA干擾方法明確了VX—680靶向Aur—A激酶誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯示出其特異性高的優(yōu)勢(shì)。因此，VX—680作為新的分子靶向藥物以其特異性高、效果顯著而顯示出其在腫瘤靶向治療中的光明前景。 4.VX—680誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，包括：G2/M期阻滯、紡錘體單極化，同時(shí)下調(diào)抗凋亡因子Bcl—2的表達(dá)，更重要的是下調(diào)了Survivin的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制Aur—A可降低Survivin

9、Thr34位的磷酸化，從而降低Survivin蛋白的穩(wěn)定性，揭示了Aur—A所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡可通過(guò)抑制Survivin進(jìn)行介導(dǎo)，為VX—680與其它化療藥物的聯(lián)合使用提供了理論依據(jù)。 5.Aur—A的小分子抑制劑VX—680與DNA損傷藥物多柔比星聯(lián)合作用可協(xié)同抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且該協(xié)同作用與降低Survivin的表達(dá)相關(guān)，提示在腫瘤治療中，可在傳統(tǒng)的化療基礎(chǔ)上聯(lián)合靶向小分子抑制劑。兩藥聯(lián)用，不僅可以提高現(xiàn)有的治療