紫杉醇和吡柔比星治療骨肉瘤的分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于10～20歲的青少年，惡性程度高，預(yù)后差，手術(shù)和化療在臨床治療骨肉瘤提高患者生存期中發(fā)揮著重要和關(guān)鍵的作用[2]。但是，在骨肉瘤復(fù)發(fā)患者的化療中發(fā)現(xiàn)存在高的失敗率和較低的中位生存率。研究骨肉瘤化療機(jī)制對骨肉瘤的治療和提高病人的生存率是非常必要的。吡柔比星已臨床用于治療骨肉瘤，而紫杉醇只作為治療骨肉瘤的二線用藥而且應(yīng)用不如吡柔比星。目前已有吡柔比星和紫杉醇在臨床上聯(lián)合應(yīng)用的報道。然而，很少有對

2、化療藥物誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的研究。因此，為了找到更加合理和有效的綜合治療方案，本實驗研究了吡柔比星和紫杉醇誘導(dǎo)凋亡活性的分子機(jī)制。
　　 方法：將MG.63細(xì)胞置于37℃，飽和濕度50％CO2的10％DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后期用于實驗。
　　 1.光鏡觀察：將不同濃度的紫杉醇和吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下定時觀察細(xì)胞的生長情況并照相。
　　 2.MTT實驗：調(diào)

3、整細(xì)胞濃度為5×104/ml，以每孔200ul培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)入對數(shù)生長期后采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測不同濃度紫杉醇（10、102、103、104nmol/L）和吡柔比星（102、103、104、105nmol/L）對細(xì)胞的生長抑制作用。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：采用不同濃度的紫杉醇和吡柔比星作用MG-63觀察對照組（不含藥）和102nmol/L紫杉醇組和103nmol/L吡柔比星組作用時間分為12h、

4、24h、48h和72h后收集細(xì)胞。收集細(xì)胞1000r/min離心5min，調(diào)整濃度為5×106個，用PBS洗一次，離心去上清；加入冰預(yù)冷的70％的乙醇固定，4℃放置1h，離心后去固定液，用3mlPBS重懸5min后1000r/min離心5min，棄上清；加入碘化丙鍵（Prooidium Iodide，PI：50mg/L Trinton X-1001.0％）室溫避光染色30min，用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布

5、，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。
　　 4.Western印跡法觀察紫杉醇及吡柔比星作用后的人成骨肉瘤細(xì)胞：MG-63的PCNA、cyclinD1、cyclinE、Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1）倒黃相差顯微鏡下觀察可見經(jīng)102nmol/L紫杉醇處理：MG-63細(xì)胞12h后，細(xì)胞折光變強，部分細(xì)胞體積變小變圓，24h后細(xì)胞開始皺縮，貼壁能力差，細(xì)胞體積更小，少量細(xì)胞漂浮，48h后細(xì)胞體積普遍變小，胞質(zhì)濃

6、縮，大量細(xì)胞變圓漂浮，72h后大部分細(xì)胞變圓，失去增殖能力漂浮于液體中，出現(xiàn)明顯的藥物抑制現(xiàn)象。103nmol/L吡柔比星作用12h后細(xì)胞增值數(shù)量減少，細(xì)胞體積增大胞膜破裂胞質(zhì)外溢，細(xì)胞壞死漂浮，24h后分裂期細(xì)胞少見，胞膜破裂細(xì)胞壞死，漂浮細(xì)胞增多，48h后大部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積增大，壞死漂浮，存活細(xì)胞顏色晦暗，生長停滯，72h后漂浮壞死細(xì)胞明顯增多。
　　 （2）不同濃度（10、102、103、104nmol/L）紫杉醇

7、和不同濃度（102、103、104、105nmol/L）吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞12h、24、48、72h，MTT結(jié)果顯示紫杉醇和吡柔比星均能明顯抑制MG-63細(xì)胞增殖，并呈劑量和時間依賴性（p<0.01）。
　　 （3）FCM分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度（10、102、103、104nmol/L）紫杉醇處理細(xì)胞24h及相同濃度（102nmol/L）紫杉醇處理細(xì)胞12h、24h、48h、72h后，G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰，G2/M期

8、所占比例隨藥物濃度和時間增加呈上升趨勢，而G1期所占比例呈遞減趨勢。不同濃度（10、102、103、104、105nmol/L）吡柔比星處理細(xì)胞24h及相同濃度（103nmol/L）吡柔比星處理細(xì)胞12h、24h、48h、72h后未見明顯凋亡峰出現(xiàn)，S期所占比例隨藥物濃度和作用時間增加呈上升趨勢。
　　 （4） western-bloting結(jié)果：經(jīng)紫杉醇和吡柔比星處理過的骨肉瘤細(xì)胞與對照組相比均表現(xiàn)出PCNA、cyclinD、

9、cyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá)抑制，Bax蛋白表達(dá)增強。
　　 結(jié)論：
　　 （1）紫杉醇和吡柔比星均對骨肉瘤細(xì)胞MG-63存在抑制細(xì)胞增殖作用且具有時間.劑量依賴關(guān)系。隨時間延長不同濃度吡柔比星對細(xì)胞的最終抑制作用是一致的。凋亡峰最高時的濃度可能是最適濃度。低濃度紫杉醇長時間和高濃度紫杉醇短時間對細(xì)胞抑制作用一致。濃度和時間不是很重要的選擇，凋亡峰最高的時間和濃度效果最佳。
　　 （2）紫杉醇對骨肉瘤細(xì)胞M

10、G-63顯示出G2/M阻滯作用，并且有一定的時間.劑量依賴性，使細(xì)胞周期受到阻滯，并進(jìn)一步誘導(dǎo)其凋亡。吡柔比星在細(xì)胞增殖周期中阻斷細(xì)胞進(jìn)入G2期，使細(xì)胞停滯于S期，抑制DNA合成干擾細(xì)胞分裂。在一定范圍內(nèi)存在時間-劑量依賴性且對劑量關(guān)系更密切。不同濃度紫杉醇作用骨肉瘤細(xì)胞后G0/G1期比例整體呈下降趨勢，表明紫杉醇對細(xì)胞增殖周期的G0/G1期存在阻斷作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。不同濃度吡柔比星作用骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞G0/G1比例呈先下降

11、后上升趨勢，表明吡柔比星對骨肉瘤細(xì)胞增殖周期G0/G1期延緩作用。
　　 （3）如果S期過大時停藥可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞繼續(xù)分裂，且分裂很快，如果是G2/M期，停藥后細(xì)胞很快進(jìn)入S期。細(xì)胞被阻滯于G0期是最有效的。濃度過低時未見明顯凋亡峰說明藥物只殺傷正常細(xì)胞達(dá)不到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。濃度過高時仍無明顯凋亡峰出現(xiàn)，表明濃度過高時凋亡較少且相對副作用較大。只有合適有效濃度時，即凋亡峰明顯時達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。吡柔比星還可能通過破壞骨肉