基于水稻全長cDNA的大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系的構(gòu)建.pdf

1、種質(zhì)創(chuàng)新是作物種質(zhì)資源有效利用的前提和關(guān)鍵,是順利開展作物遺傳育種工作的基礎(chǔ)和保證.50多年來,我國作物種質(zhì)創(chuàng)新在促進(jìn)農(nóng)業(yè)新品種更新?lián)Q代、提高糧食產(chǎn)量、保障我國的糧食安全等方面做出了巨大貢獻(xiàn).大豆是人類食用油和蛋白質(zhì)的主要來源,而普通栽培大豆遺傳基礎(chǔ)過于狹窄、傳統(tǒng)種質(zhì)創(chuàng)新周期過于漫長,難以滿足大豆育種的需求.此外,國外對基因的專利保護(hù)更是影響了我國大豆轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程.因此,改善現(xiàn)有的大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù),不斷提高大豆種質(zhì)創(chuàng)新效率,將是緩解

2、作物種質(zhì)資源相對貧乏與育種需求不斷增大之間矛盾所需解決的首要問題. 本研究借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理和方法,在獲得了高質(zhì)量水稻全長cDNA的前提下,開展了高通量轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的構(gòu)建以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化等方面的研究,并最終構(gòu)建了基于水稻全長cDNA的大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系.對轉(zhuǎn)基因大豆植株的組織化學(xué)檢測及分子生物學(xué)的檢測結(jié)果證明了該種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系的可行性.大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系的建立為農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新突破國外基因?qū)＠Ｗo(hù),充分發(fā)揮

3、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用潛力以及實現(xiàn)優(yōu)異農(nóng)藝性狀的跨種、屬間的基因交流提供了全新的思路.本研究取得的主要研究結(jié)果如下所述: 1.高質(zhì)量水稻全長cDNA的獲得.本研究以抗逆性水稻品種靖粳7號、合系15號、珍珠42、遼鹽16、早稻277、及旱稻502為材料,得到了不同時間點混合的水稻抗旱、耐鹽、耐冷脅迫處理下的總RNA,利用SMART技術(shù)合成水稻全長cDNA,利用pGEM-T easy載體試劑盒克隆所得水稻cDNA,單克隆菌

4、液PCR擴(kuò)增結(jié)果表明所得水稻ds cDNA片段平均長度為900bp,插入片段大小分布在0.3～2kb. 2.攜帶不同大小水稻cDNA高效表達(dá)載體的構(gòu)建.經(jīng)過片段分級的水稻cDNA采用平末端連接和T-A連接兩種方案分別與具有相應(yīng)末端的雙元表達(dá)載體質(zhì)粒DNA連接并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,制備含有連接著水稻不同大小cDNA表達(dá)載體的工程菌液,用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化.對平末端連接和T-A連接兩種連接效果的鑒定結(jié)果顯示得到了連接有外源水稻cDN

5、A的質(zhì)粒表達(dá)載體,連接效率為60﹪～75﹪,連接效率較低,有待改進(jìn). 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.選用了3個大豆栽培品種中品661、墾農(nóng)18和綠75,在已有研究基礎(chǔ)上,本文首次探索了介于子葉節(jié)和胚尖之間的新的外植體類型,即帶有1片子葉的胚尖,該方法大大縮短了試驗流程,而且此轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的再生率達(dá)90N以上(中品661為95﹪;墾農(nóng)18為93﹪;綠75為90﹪),高于子葉節(jié)的50﹪和胚尖的70﹪;分子檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)

6、化效率高達(dá)10﹪(墾農(nóng)18).因此,本研究建立的大豆農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)體系較前人的更加快速、高效,將是從事農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因、突變體構(gòu)建等基因組學(xué)研究強有力的技. 4.新型大豆種質(zhì)創(chuàng)新體系的驗證.將連接有水稻不同全長cDNA的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后,借助于本研究初步建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆新型外植體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系,獲得了500多株大豆轉(zhuǎn)基因再生植株.經(jīng)過對大豆再生植株的組織化學(xué)GUS僉測、PCR.及Southern雜交等分子生物

7、學(xué)檢測,結(jié)果表明水稻cDNA已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了大豆基因組中,證明了本研究所探索的基于水稻全長cDNA的大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系是可行的. 5.與傳統(tǒng)的種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)相比,本研究構(gòu)建的基于水稻全長cDNA的大豆種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)體系具有如下的優(yōu)點: (1)外源基因不受基因?qū)＠南拗?本技術(shù)體系所需的外源基因直接來自水稻全長cDNA,不必知道所轉(zhuǎn)基因的序列,突破了國外基因?qū)＠谋趬?(2)最大限度地突破物種間的生殖隔離:利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理和方法使得