小麥全長cDNA文庫構(gòu)建、測序與分析.pdf

1、本文在引進(jìn)、消化吸收的基礎(chǔ)上，對Cap-trapper法做了進(jìn)一步的改進(jìn)，形成了一套簡單易行的技術(shù)體系，建立了全長cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)平臺。利用改進(jìn)的Cap-trapper法，分別構(gòu)建了不同倍性、不同組織、不同處理的小麥全長cDNA文庫10個，涉及普通小麥(AABBDD)及其三個二倍體祖先種(AA、SS和DD)和四倍體波斯小麥(AABB)共計小麥的5個種，涉及幼苗、根、愈傷組織、花藥、胚乳，并設(shè)有白粉菌誘導(dǎo)誘導(dǎo)與對照等。所建文庫插入片段

2、平均為1.5kb左右，原始文庫的庫容量在6.0×105～5.0×106pfu之間，經(jīng)后期測序并與GenBank公布的小麥全長mRNA序列比對分析表明克隆的全長比例為93％左右，擴(kuò)增文庫滴度在1010pfu/ml數(shù)量級，適合于大規(guī)模測序需要，是開展小麥功能基因?qū)W研究的寶貴資源。 試驗從10個全長cDNA文庫隨機挑取大約11萬個克隆進(jìn)行3’端測序，獲得106,671條3’端EST，去除冗余后選擇代表性克隆進(jìn)行了克隆5’端測序，獲得3

3、1,732條5'EST，共獲得138,403條EST，得到高質(zhì)量序列(Q20)數(shù)據(jù)7.46×107bp。在去除ployA和短于100bp的序列后獲得5'EST和3'EST分別為30,586條和95,736條。經(jīng)cap3軟件聚類分析表明試驗獲得了32,899條不重復(fù)克隆。 GC含量統(tǒng)計表明小麥族基因cDNA序列中GC含量為54.0％，這與水稻基因組GC含量基本一致(53.4％)，而與擬南芥有明顯差別(40.7％)；5’和3’EST

4、比較發(fā)現(xiàn)5’端GC含量為57.80％，明顯高于3’的GC含量(52.8％)。推測小麥基因的這種高GC含量特別是5’端高GC含量是小麥全長基因克隆和測序困難的原因之一。 將獲得的32,899條不重復(fù)序列使用blast軟件將比對參數(shù)E值設(shè)為1e-20對879,695條小麥公共EST數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性搜索，結(jié)果表明8,800條為新的小麥EST(26.75％)；使用參數(shù)1e-5對水稻32,127條全長cDNA序列比對結(jié)果表明15,992條(

5、48.6％)序列在水稻全長cDNA中沒有對應(yīng)序列。同時，利用1e-20的參數(shù)對水稻1,191,102條水稻EST數(shù)據(jù)blast結(jié)果表明18,672條沒有相應(yīng)序列(56.75％)；用該數(shù)據(jù)集對華大基因組研究所測序的水稻基因組序列blastn搜索結(jié)果表明14,382條(43.72％)在水稻基因組序列中沒有對應(yīng)序列(E-value1e-5)。 密碼子使用的偏愛性是生物在長期進(jìn)化過程中逐漸形成的，影響偏愛性的因素有多種，如G+C含量，基

6、因表達(dá)水平，基因的長度，tRNA的豐度等等。我們隨機挑取了750條全長序列使用codonW軟件對小麥密碼子使用偏愛性進(jìn)行了分析，統(tǒng)計結(jié)果表明小麥基因密碼子第三位GC含量為54％左右，與表達(dá)基因的整體GC含量一致；同時發(fā)現(xiàn)小麥優(yōu)先使用的密碼子27個，所有優(yōu)先使用的密碼子均以G或者C結(jié)尾，無一例外，這與水稻的情況非常一致；而擬南芥為低GC含量物種，僅為44％，所有優(yōu)先使用的密碼子均以A或者T結(jié)尾。說明植物進(jìn)化過程中單雙子葉植物分開后首先GC

7、含量趨異非常明顯，進(jìn)而密碼子優(yōu)先使用特性也完全不同。 使用基于Linux平臺的本地化分析平臺系統(tǒng)對獲得32,899條序列進(jìn)行了分子功能、生物過程和細(xì)胞組分三個層次的GeneOntology注釋，獲得了小麥基因的多層次注釋信息。 使用GO-Diff軟件，基于GO分類信息和基因表達(dá)譜信息對來自粗山羊草根和葉兩種組織全長cDNA文庫的EST進(jìn)行文庫間基因表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)了許多組織間表達(dá)差異顯著的基因和一些組織特異性的基因。比

8、如下面的16個基因只在根中檢測到有表達(dá)，分別是4-香豆酸輔酶A接合酶(4-coumarate-CoAligase)、酸硫醇連接酶(acid-thiolligase)、腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)、β葡糖苷酶(beta-glucosidase0)、纖維素酶(cellulase)、輔酶A連接酶(CoA-ligase)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase)、谷氨酰胺－果糖－6

9、－磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-fructose-6-phosphatetransaminase(isomerizing))、醚水解酶(hydrolaseactivity，actingonetherbonds)、分子內(nèi)氧化還原酶(催化分子內(nèi)酮式－乙醇式轉(zhuǎn)換)(intramolecularoxidoreductase，interconvertingketo-andenol-groups)、分子內(nèi)氧化還原酶(置換二硫鍵)(intram

10、olecularoxidoreductaseactivity，transposingS-Sbonds)煙酰胺合成酶(nicotianaminesynthase)、6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶(phosphogluconatedehydrogenase(decarboxylating))、脯氨酸脫氫酶(prolinedehydrogenase)、蛋白二硫異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase)和三烷基磺酰脫氫酶(trialk

11、ylsulfoniumhydrolase)；而僅在葉組織中檢測到高表達(dá)的基因為氧化還原酶(oxidoreductase)、碳酸鹽脫水酶(carbonatedehydratases)、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯環(huán)化酶(magnesium-protoporphyrinⅨmonomethylester(oxidative)cyclases)、原葉綠素酸酯還原酶(protochlorophyllidereductase)、絲氨酸酯酶(serineeste

12、rase)、羧酸酯酶(carboxylesterase)、甘油醛3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等。同時，將公共數(shù)據(jù)庫GenBank公布的中國春小麥可育花藥EST的34,615條與我們構(gòu)建的矮敗中國春花藥幼穗混合庫測序獲得的33051條EST比較分析也獲得了組織特異性表達(dá)的基因。這種基于大規(guī)模測序并挖掘背景相同育性不同材料中表達(dá)基因的差異將為小麥雄性不育的分子機理研究提供了基