興凱湖梅花鹿肝臟全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁
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1、本試驗(yàn)以興凱湖梅花鹿肝臟組織為研究材料,用Trizol方法提取興凱湖梅花鹿肝臟組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,長(zhǎng)距離PCR方法合成雙鏈cDNA;PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K水解、純化后,用SfiI酶切;將酶切產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離,回收400bp以上的cDNA組分,并與λTriplEx2載體連接;連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝,產(chǎn)生原始文庫(kù);鑒定文庫(kù)的滴度和重組效率后,進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增.隨機(jī)挑取96個(gè)噬菌斑,用載體克隆位點(diǎn)兩端的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)

2、所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的質(zhì)量.經(jīng)測(cè)定該文庫(kù)初始滴度為7.9×10m<'5>pfu/ml,擴(kuò)增后滴度為1.06x10<'9>pfu/ml,重組率為88﹪.插入片段長(zhǎng)度為0.3～3.0kb.同時(shí),由于反轉(zhuǎn)錄過程中采用附加序列的方法使全長(zhǎng)mRNA得到反轉(zhuǎn)錄,所以得到的cDNA是完整的,完全符合cDNA文庫(kù)的要求.本試驗(yàn)成功構(gòu)建了興凱湖梅花鹿肝臟組織的cDNA文庫(kù). 興凱湖梅花鹿肝臟組織表達(dá)型九噬菌體cDNA文庫(kù)的成功構(gòu)建,不僅保存了珍貴的梅花鹿

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