水稻全長cDNA文庫的構(gòu)建和兩個(gè)microRNA的功能研究.pdf

1、水稻是全球最重要的糧食作物之一。水稻遺傳改良的關(guān)鍵是尋找能調(diào)節(jié)水稻株高、分蘗數(shù)、抽穗期、穗的大小和育性等重要農(nóng)藝性狀的基因。以MicroRNA為代表的內(nèi)源small RNA分子是生物生長發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為水稻的遺傳改良提供了新的基因資源。
　　 本研究包含三方面的內(nèi)容：一是構(gòu)建水稻全長cDNA文庫，得到13000個(gè)以上的全長cDNA克隆，同時(shí)構(gòu)建用于酵母雙雜交篩選的cDNA文庫；二是系統(tǒng)的分析水稻中的OsSPL(0ryza S

2、ativa SQUAMOSA Promoter-binding Like)基因，特別是miR156的靶基因；三是以篩選控制水稻重要農(nóng)藝性狀的small RNA基因?yàn)槟繕?biāo)，重點(diǎn)研究miR156和miR164在水稻生長發(fā)育中的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 cDNA文庫的構(gòu)建的結(jié)果如下：
　　 1.利用改良的Oligo-capping方法構(gòu)建了全長比例在92％以上的水稻幼穗的cDNA文庫，并對(duì)3000個(gè)隨機(jī)挑選的克隆測(cè)序。此外，從本實(shí)驗(yàn)室

3、已有的cDNA文庫中篩選了10828個(gè)包含完整讀碼框的cDNA克隆?？偣驳玫搅?3650個(gè)全長cDNA克隆。
　　 2.構(gòu)建了兩個(gè)用于酵母雙雜交的cDNA文庫，在本實(shí)驗(yàn)室已成功用于轉(zhuǎn)錄因子、mRNA剪切因子、未知基因等不同類型基因的互作蛋白的篩選，假陽性率在10％以下。
　　 miR156及靶基因OsSPL基因分離鑒定的主要結(jié)果如下：
　　 1.分析了水稻中miR156的靶基因OsSPL家族。主要包括水稻中18個(gè)

4、OsSPL基因的分離、植物中SPL基因的進(jìn)化分析、保守結(jié)構(gòu)域的分析，并分析了OsSPL基因在水稻的13不同發(fā)育時(shí)期的組織中的表達(dá)水平。對(duì)8個(gè)OsSPL基因進(jìn)行了超表達(dá)。
　　 2.序列分析表明水稻中11個(gè)OsSPL基因含miR156的結(jié)合位點(diǎn)(M156BR，miR156 binding region)。通過Northern blot的結(jié)果表明，OsSPL12和OsSPL14的mRNA分子被miR156-RISC切斷。
　　

5、 3.RLM-RACE分析OsSPL14和OsSPL17被miR156-RISC切斷的位置。miR156-RISC在M156BR的第7和8個(gè)核酸之間的位置切斷靶基因，正好位于M156BR與miR156錯(cuò)配的核酸的位置。
　　 4.對(duì)miR156的一個(gè)靶基因OsSPL14進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，得到不受miR156調(diào)節(jié)的基因OsSPL14m1和OsSPL14m2，并對(duì)OsSPL14m2進(jìn)行了超表達(dá)。
　　 5.通過Y2H篩選穗的

6、cDNA文庫，得到了OsSPL14的6個(gè)互作蛋白。其中三個(gè)是與ubiquitin途徑相關(guān)的RING finger類蛋白，表明OsSPL14除了受 miR156調(diào)節(jié)外，蛋白的穩(wěn)定性可能還受ubiquitin途徑的調(diào)節(jié)。miR156和miR164功能研究主要結(jié)果如下：
　　 1.在玉米Ubiquitin啟動(dòng)子的作用下超表達(dá)了miR156和miR164，得到了 miR156的兩個(gè)前體(pri-miR156b和pri-miR156h)的

7、超表達(dá)植株(Md和 Mh)和miR164一個(gè)前體(pri-miR164b)的超表達(dá)植株(MI7)。
　　 2.分析了Md和Mh的T4代植株與WT(wild type)在生長和發(fā)育上的差異。在苗期(四葉期以前)Md和Mh與WT無差異。在第四葉生長出以后， Md和Mh的葉片和分蘗發(fā)生的速度是WT的3倍以上。到灌漿期，Md和 Mh植株葉片的數(shù)目是WT的100倍以上，有效分蘗的數(shù)目是WT的50倍以上。在大田種植條件下(武漢7月至10月)

8、Md和Mh的營養(yǎng)生長延長，抽穗期推遲7天以上。Md和Mh植株高度只有WT的50％，穗的二次枝梗和穎花數(shù)變少。通過比較Md和Mh的葉片大小、葉片表皮細(xì)胞的發(fā)育情況和SAM(shoot apical meristem)的大小，推斷miR156超表達(dá)改變了水稻的發(fā)育時(shí)間。
　　 3.通過small RNA gel blot分析miR156在不同“年齡”的葉片中的表達(dá)水平表明miR156的高低與葉片發(fā)育時(shí)間正相關(guān)，miR156是葉片發(fā)育

9、時(shí)間的 Marker基因。
　　 4.利用水稻的全基因組芯片分析了Md/Mh和WT植株的老葉和新葉中基因的表達(dá)情況，并據(jù)此分析miR156的下游基因以及葉片發(fā)育時(shí)間相關(guān)的基因。
　　 5.比較了含M156BR的OsSPL基因在Md/Mh和WT不同器官中的表達(dá)量，結(jié)果表明miR156-OsSPL基因的互作受其他因子的調(diào)節(jié)，可能的調(diào)節(jié)因子有DRG12和已報(bào)道的PLA2。
　　 6.在葉片的生長發(fā)育過程中miR164表

10、達(dá)模式與miR156正好相反，說明兩者在葉片的發(fā)育過程中存在聯(lián)系。同時(shí)在small RNAgel blot中還檢測(cè)到一個(gè)表達(dá)模式與成熟miR164相反的未知前體，表明miR164的水平受啟動(dòng)子和 microRNA形成過程的雙重調(diào)節(jié)。
　　 7.序列分析表明水稻中僅有OsNACI和OsNAC2含M164BR(miR164 bind region)。RLM-RACE分析也證明OsNAC1和OsNAC2的mRNA在M164BR第10個(gè)

11、核酸的位置被切斷。OsNAC1和OsNAC2的轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育時(shí)間的葉片中，表達(dá)模式與miR164的表達(dá)模式相反。
　　 8.miR164能調(diào)節(jié)水稻葉片的邊界。在miR164超表達(dá)的MI7植株中，葉鞘邊緣融合、部分葉片融合或扭曲，在一些極端的植株中有類似擬南芥 cup-shaped的結(jié)構(gòu)形成。MI7葉片發(fā)育的缺陷隨植株生長時(shí)間的增加而加劇。
　　 9.miR164調(diào)節(jié)水稻的生殖生長。MI7的花藥形態(tài)發(fā)育異常，花粉完全不育

12、。 MI7雖能正常開花，但胚和胚乳不能正常發(fā)育。正常抽穗開花的MI7主分蘗的倒數(shù)第二個(gè)節(jié)(穗頸節(jié)的前一個(gè)節(jié))未伸長。MI7的葉片中，一個(gè) Flowers Locus T(FT)的同源基因(MI7D1)被抑制。在長日照條件下， OsNAC1、OsNAC2和MI7D1的表達(dá)與日照有關(guān)，OsNAC1和OsNAC2表達(dá)的最高峰在黑暗時(shí)間段的正中點(diǎn)。
　　 10.miR164的超表達(dá)改變了水稻體內(nèi)的激素水平。通過外施生長素和細(xì)胞分裂素可以

13、使MI7生長發(fā)育恢復(fù)正常。在MI7植株中部分生長素合成、運(yùn)輸和應(yīng)答的基因被抑制。
　　 11.通過比較不同植物中miR156和miR164的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR156-miR164在禾本科作物中保守，但在油菜葉片中存在不同的表達(dá)模式。
　　 12.根據(jù)以上結(jié)果，可以推斷出以下結(jié)論：miR156是控制水稻發(fā)育特別是葉片發(fā)育的異時(shí)性基因。miR164在水稻中除了調(diào)節(jié)器官邊界外，還具有與擬南芥中不同的功能一調(diào)節(jié)水稻的生殖生長。最后