皂角刺總黃酮誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的:細(xì)胞凋亡,是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,由基因調(diào)控的主動死亡的過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療惡性腫瘤的重要途徑之一。皂角刺總黃酮(Flavonoidsfrom Spina Gleditsiae,FSG)是從中藥皂角刺中提取分離得到的黃酮類化合物,前期研究結(jié)果顯示,皂角刺總黃酮對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。本研究通過檢測皂角刺總黃酮對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響,觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化、

2、凋亡率和Caspase-3的活性水平變化,從細(xì)胞水平和分子水平探討皂角刺總黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,旨在闡明其抗腫瘤作用的機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實驗依據(jù)。方法:體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天傳代一次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞作實驗對象,用不同濃度(12.5、25、50、100、200)mg·L-1的皂角刺總黃酮分別處理24、48和72

3、小時后,采用CCK-8試劑盒(CellCountingKit-8)檢測皂角刺總黃酮溶液對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用；將經(jīng)FSG處理的HCT116細(xì)胞,分別采用常規(guī)HE染色和Hoechst33258熒光染色觀察誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法定量檢測凋亡細(xì)胞的凋亡率,透射電子顯微鏡法檢測皂角刺總黃酮對細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的影響,用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測皂角刺總黃酮對凋亡細(xì)胞中Caspase-3

4、蛋白活性的影響,并用統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果:不同濃度(12.5、25、50、100、200mg·L-1)的皂角刺總黃酮處理HCT116細(xì)胞24、48和72小時后,均能明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖,隨著藥物濃度的增加,抑制作用越強(qiáng),但以作用48小時的抑制作用最強(qiáng),抑制率分別為(0.04±0.1)％、(3.22±1.11)％、(21.71±4.71)％、(47.24±7.56)％和(78.03±10.38)％mg·L-1,半數(shù)抑制濃

5、度IC50為104±0.96mg·L-1。皂角刺總黃酮作用于HCT116細(xì)胞48小時后,HE染色可見不同程度的核固縮、胞體變小、染色質(zhì)凝聚深染和細(xì)胞貼壁率下降等改變。Hoechst33258熒光染色顯示,不同濃度的皂角刺總黃酮溶液干預(yù)HCT116細(xì)胞后,可見核濃縮、致密的強(qiáng)熒光團(tuán)塊、核碎裂及凋亡小體等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。AnnexinV/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,皂角刺總黃酮可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡,(12.5、2

6、5、50、100、200)mg·L-1皂角刺總黃酮的凋亡率分別為(8.074±2.19)％、(14.55±3.04)％、(20.83±2.73)％、(35.61±3.76)％和(43.90±7.52)％,凋亡率隨著藥物濃度的增高而變大,與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。透射電子顯微鏡檢測顯示,經(jīng)(25、50、100)mg·L-1的皂角刺總黃酮處理后的細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹,細(xì)胞質(zhì)濃縮,核固縮,核內(nèi)染色質(zhì)聚集于核膜內(nèi)側(cè)成團(tuán)塊