p53在白藜蘆醇誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞自噬和凋亡過(guò)程中的作用.pdf

1、目的:
　　白藜蘆醇(RSV;3，4'，5-trihydroxystilbene)是一種天然的植物抗毒素，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并且能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或自噬進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。多篇報(bào)道表明腫瘤抑制基因p53能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬，但由于條件差異p53對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的作用不同。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法，研究p53在白藜蘆醇誘導(dǎo)結(jié)腸

2、癌細(xì)胞自噬和凋亡過(guò)程中的作用，為結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和凋亡機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.MTT法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇(0μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞24 h、48h、72h后細(xì)胞生存率變化。
　　2.單丹磺酰戊二胺(MDC)染色觀察不同濃度白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p5

3、3+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞24 h、48h、72h后細(xì)胞的酸性自噬泡結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化。
　　3.免疫熒光檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+細(xì)胞24h、48h后自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)和分布。
　　44，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察100μM的白藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞0h、24 h、48 h、7

4、2 h后細(xì)胞核變化及凋亡現(xiàn)象。
　　5.Western Blot方法檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞24h、48h、72h及同一濃度(100μM)的白藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞0h、24h、48h、72h后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、C-Beclin1的表

5、達(dá)量，分析p53對(duì)細(xì)胞自噬、凋亡的影響。
　　6.用p53激動(dòng)劑Nutlin-3與白藜蘆醇共同處理HCT-116p53+/+細(xì)胞24h，Western Blot檢測(cè)Beclin1、LC3的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)p53與自噬的關(guān)系。
　　7.Caspase-3試劑盒檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞48h、72h及同一濃度(100μM)的白

6、藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞0h、24h、48h、72h后Caspase-3酶活性，進(jìn)一步證實(shí)p53與凋亡的關(guān)系。
　　8白藜蘆醇0μM、100μM分別作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞24h，以兔(R) IgG和鼠(M) IgG作為陽(yáng)性對(duì)照，Beclin1為沉淀抗體，檢測(cè)Beclin1與Bcl-2是否相關(guān)。
　　9.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析

7、處理，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果以x±SD表示，均以P＜0.05為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.白藜蘆醇對(duì)HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞生存率的影響MTT結(jié)果顯示，白藜蘆醇對(duì)HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞均有抑制作用，且對(duì)HCT-116p53-/-細(xì)胞的抑制更明顯。
　　2.白藜蘆醇對(duì)HCT-116p53+/+和HCT-1

8、16p53-/-細(xì)胞自噬的影響
　　MDC染色結(jié)果顯示，在白藜蘆醇的影響下，HCT-116p53+/+細(xì)胞MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞自噬泡逐漸增多且增強(qiáng)，自噬明顯;HCT-116p53-/-細(xì)胞MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞自噬泡有逐漸減少且減弱的趨勢(shì)，自噬現(xiàn)象不明顯。
　　免疫熒光結(jié)果顯示LC3主要定位在HCT-116p53+/+細(xì)胞的細(xì)胞漿中，LC3熒光強(qiáng)度隨著白藜蘆醇的濃度增加而升高。
　　Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白，

9、結(jié)果顯示HCT-116p53+/+細(xì)胞中，Beclin1、LC3Ⅱ的表達(dá)均隨著白藜蘆醇濃度的增加而逐漸增強(qiáng);Beclin1隨白藜蘆醇作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，LC3Ⅱ在0-48h時(shí)隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在48-72h時(shí)隨時(shí)間的延長(zhǎng)LC3Ⅱ的表達(dá)減弱。而在HCT-116p53-/-細(xì)胞中，Beclin1的表達(dá)隨白藜蘆醇濃度的增加而逐漸降低，隨白藜蘆醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。
　　3.p53激動(dòng)劑Nutlin-3作用下，p53對(duì)白

10、藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+細(xì)胞經(jīng)Nutlin-3處理后，Beclin1、LC3Ⅱ表達(dá)均隨p53的增加而增多，MDM2對(duì)應(yīng)表達(dá)增多。在Nutlin-3與白藜蘆醇共同處理的三者中比較，隨p53表達(dá)增多，MDM2表達(dá)降低;在白藜蘆醇處理的三者中比較，隨p53表達(dá)增多，MDM2表達(dá)降低。
　　4.白藜蘆醇對(duì)HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞凋亡的

11、影響
　　DAPI染色結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞均發(fā)生了凋亡，但HCT-116p53-/-細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量和凋亡程度明顯大于HCT-116p53+/+細(xì)胞。
　　Caspase-3酶活性結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞的Caspase-3酶活性均隨著白藜蘆醇濃度的升高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但HCT-116p53-

12、/-細(xì)胞Caspase-3酶活性明顯強(qiáng)于HCT-116p53+/+細(xì)胞。
　　Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，在HCT-116p53+/+細(xì)胞中，Bax、Bcl-2的表達(dá)均隨著白藜蘆醇濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。在HCT-116p53-/-細(xì)胞中，N-Beclin1的表達(dá)隨著白藜蘆醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，C-Beclin1的表達(dá)隨著白藜蘆醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。
　　5.Beclin1與

13、Bcl-2的相互作用對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞自噬的影響
　　免疫沉淀結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞中的Beclin1與Bcl-2相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.白藜蘆醇能誘導(dǎo)HCT-116 p53+/+和HCT-116p53-/-細(xì)胞自噬與凋亡共存。對(duì)于HCT-116p53+/+細(xì)胞，白藜蘆醇主要通過(guò)自噬性細(xì)胞死亡的方式抑制其生長(zhǎng);在HC