紅花對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎上腺髓質(zhì)素及基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種原因?qū)е履I組織病變的最終結(jié)果，在腎臟病的進(jìn)展中有重要意義。目前認(rèn)為RIF的發(fā)病主要是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積與降解失衡所致[1]。近年來隨著對腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機制的深入研究，腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)系統(tǒng)對RIF影響的研究逐漸成為研究熱點之一。ADM是一種新的舒血管活性肽類，近期研究表明ADM具有抑制TGFβ1(transforming growth

2、 factor-β1)刺激膠原合成和分泌的作用，而TGFβ1是最關(guān)鍵的促纖維化生長因子。此外調(diào)控ECM代謝的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的表達(dá)與活性異常，也在RIF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。 就中醫(yī)對慢性腎病的病機并結(jié)合腎臟病理改變而言，后期包括腎纖維化時以本虛為主，逐漸發(fā)展成瘀滯的本虛標(biāo)實病理現(xiàn)象。結(jié)合久病入絡(luò)及腎臟病理改變，瘀血貫穿整個慢性腎病過程，具有普遍性[2]。紅花是常用的活血化瘀中

3、藥，在臨床廣泛使用于心腦血管疾病，在腎臟疾病中也具有很好的效果。本實驗應(yīng)用中藥紅花對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateralureteral obstruction，UUO)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療并以血管緊張素受體拮抗劑纈沙坦(Valsartan)為對照，旨在通過觀察紅花對實驗動物梗阻側(cè)腎臟相關(guān)調(diào)控因子-轉(zhuǎn)化生長因子β1、Ⅲ型膠原(collagenⅢ，ColⅢ)、ADM及其受體、ECM重要降解酶系.基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS

4、)及其抑制因子(TIMPs)的影響，探討紅花對腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用及作用機理。方法：本實驗研究選用雌性SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，分別置代謝籠里取尿，測定尿蛋白及尿紅細(xì)胞全部陰性，隨機分為4組，假手術(shù)組(Sham group)、模型組(UUogroup)、纈沙坦組(UUOV group)、紅花組(UUOS group)，每組10只，除假手術(shù)組外，各組動物結(jié)扎左側(cè)輸尿管并在術(shù)前一天灌胃給藥，假手術(shù)組與模型組分別灌入等量的生理鹽水，

5、于實驗第21天全部殺檢，取左側(cè)。腎臟分別采用免疫組化及原位雜交方法檢測TGFβ1、ColⅢ、ADM及其受體、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子在蛋白及基因水平的表達(dá)。 結(jié)果：①ColⅢ蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：ColⅢ主要表達(dá)于腎間質(zhì)，假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)ColⅢ呈弱陽性表達(dá)，其余各組表達(dá)顯著增強，為條索狀或成片塊狀。其中，模型組與假手術(shù)組相比ColⅢ的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.01)；纈沙坦組、紅花組與模型組

6、相比，ColⅢ的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示紅花、纈沙坦均可抑制梗阻側(cè)腎組織中ColⅢ的蛋白表達(dá)，其中，紅花組優(yōu)于纈沙坦組，但無顯著性差異(P＞0.05)。②TGFβ1蛋白及其mRNA的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組實驗動物在腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)TGFDl蛋白及mRNA的表達(dá)均為弱陽性；其余各組表達(dá)顯著增強，見于腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及腎小球內(nèi)。其中，模型組較假手術(shù)組TGFβ1的陽

7、性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.01)：纈沙坦組、紅花組與模型組相比，TGFβ1的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示紅花、纈沙坦均可抑制梗阻側(cè)腎組織中TGFβ1的蛋白及mRNA表達(dá)。其中，紅花組優(yōu)于纈沙坦組，但均無顯著性差異(P＞0.05)。③ADM蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組大鼠在腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)呈弱陽性表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組表達(dá)顯著減弱，纈沙坦組表達(dá)較弱，

8、紅花組表達(dá)明顯增強。其中，紅花組和纈沙坦組與模型組相比ADM的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.01、P＜0.05)，其中紅花組明顯優(yōu)于纈沙坦組(P＜0.01)，提示紅花較纈沙坦更能上調(diào)ADM蛋白的表達(dá)。④ADMR蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組ADMR陽性顆粒見于腎小管上皮細(xì)胞，呈強陽性表達(dá)，與假手術(shù)組相比其余各組表達(dá)較弱，紅花組與模型組相比ADMR的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.05,P＜0.0

9、1)，提示紅花可上調(diào)梗阻側(cè)腎組織中ADMR的蛋白表達(dá)。纈沙坦組與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)。⑤ADM mRNA的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組大鼠的ADM mRNA在腎小管上皮細(xì)胞中呈強陽性表達(dá)，模型組顯著減弱，紅花及纈沙坦可使其表達(dá)增強。紅花組和纈沙坦組與模型組相比ADM mRNA的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.01)，其中紅花組明顯優(yōu)于纈沙坦組(P＜0.01)，提示紅花較纈沙坦更能調(diào)控梗阻側(cè)腎組織中

10、ADM的mRNA表達(dá)。⑥MMP-1蛋白測定結(jié)果顯示在假手術(shù)組大鼠腎臟呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)；與假手術(shù)組比較，其余各組表達(dá)顯著增強，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)強表達(dá)，其中，模型組與假手術(shù)組相比，陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高(P＜0.01)；紅花組和纈沙坦組與假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.05)，但與模型組相比，MMP-1的陽性面積及積分光密度值無顯著性差異(P＞0.05)⑦TIMP-1蛋白測定結(jié)果顯示假手術(shù)組呈弱陽性表達(dá)

11、，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿；模型組表達(dá)明顯增強，陽性面積增強近9.06倍，光密度測定增強6.14倍，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.01)；紅花組和纈沙坦組較假手術(shù)組明顯增強，但與模型組相比，其表達(dá)明顯減弱，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.05)，紅花組和纈沙坦組相比無顯著性差異。⑧MMP-1/TIMP-1比值測定：盡管在模型組和治療組之間，MMP-1無顯著性差別，均由于梗阻因素而表達(dá)增強，但這種代償性增強并不能減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積

12、，其原因就在于TIMP-1的表達(dá)更為顯著所致，計算兩者的比值，就可以了解這一系統(tǒng)對細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用。根據(jù)測定結(jié)果，假手術(shù)組MMP-1/TIMP-1光密度為1.42，模型組為0.64，紅花組為0.87，纈沙坦組為0.88，其比值說明紅花和纈沙坦有調(diào)整MMP-1/TIMP-1的作用，而且主要是由于抑制TIMP-1來發(fā)揮作用，TIMP-1mRNA的抑制，可能是拮抗腎間質(zhì)纖維化的機制之一。⑨MMP-1 mRNA采用原位雜交方式測定，結(jié)果顯示

13、假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)MMP-1mRNA呈弱陽性表達(dá)，與假手術(shù)組比較，其余各組的表達(dá)均顯著增強(P＜0.05)。模型組與假手術(shù)組相比，表達(dá)增強，其陽性面積及積分光密度值分別高出假手術(shù)組1.73倍和1.99倍，紅花組和纈沙坦組MMP-1mRNA與假手術(shù)組相比有明顯上調(diào)，但與模型組比較，陽性面積及積分光密度值無明顯差異(P＞0.05) TIMP-1 mRNA表達(dá)顯示在大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小球呈弱陽性表達(dá)，模型組陽性面積及積分

14、光密度值分別高出假手術(shù)組11.16倍和7.41倍(P＜0.01)，紅花組和纈沙坦組與模型組相比，TIMP-1 mRNA的表達(dá)被下調(diào)，測定其陽性面積與積分光密度與模型組有顯著性差別(P＜0.05)，但紅花組和纈沙坦組相比無顯著性差異。MMP-1/TIMP-1 mRNA比值顯示在假手術(shù)組為0.85，模型組為0.23，紅花組為0.34，纈沙坦組為0.37，提示在模型組存在著MMP-1與TIMP-1的失衡，這種失衡可以被紅花和纈沙坦部分糾正，尤