PRDM基因啟動(dòng)子甲基化在非小細(xì)胞肺癌中的作用研究.pdf

1、研究背景:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是危害人類健康的最主要惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制與基因啟動(dòng)子甲基化（簡(jiǎn)稱甲基化）狀態(tài)異常導(dǎo)致基因表達(dá)失常密切相關(guān)。PR區(qū)鋅指蛋白(PRDM)具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、器官發(fā)育等生命活動(dòng)，是近年備受關(guān)注的腫瘤抑制蛋白家族。PRDM基因甲基化廣泛參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制，但是與肺癌的相關(guān)性研究報(bào)道非常罕見。
　　研究目的:研究PRDM家族基因甲基化是否參與NSCLC的發(fā)病機(jī)制

2、，明確NSCLC的PRDM家族基因甲基化模式。
　　研究方法:
　　1、臨床標(biāo)本研究部分:收集52例肺鱗癌和23例肺腺癌患者的原發(fā)腫瘤組織（簡(jiǎn)稱腫瘤組織）、癌旁組織和遠(yuǎn)處對(duì)照肺組織（簡(jiǎn)稱遠(yuǎn)處肺組織）標(biāo)本;通過采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)PRDM家族基因的mRNA表達(dá)水平，篩選出腫瘤組織中表達(dá)缺失或降低的PRDM家族成員(簡(jiǎn)稱肺癌相關(guān)PRDM);然后采用甲基化特異性多聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)腫瘤組織、癌旁組

3、織和遠(yuǎn)處肺組織肺癌相關(guān)PRDM基因的甲基化狀態(tài)，免疫組織化學(xué)染色和Western-blot方法檢測(cè)肺癌相關(guān)PRDM基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;分析甲基化狀態(tài)對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響;分析腫瘤組織肺癌相關(guān)PRDM基因甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的相關(guān)性。
　　2、腫瘤細(xì)胞系研究部分:體外培養(yǎng)人肺鱗癌HTB-182細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、永生化人支氣管上皮HBE細(xì)胞，分別用0μmol/L（對(duì)照組）、1μmol/L、5μmol/L、1

4、0μmol/L的5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2dC)進(jìn)行處理，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MSP檢測(cè)PRDM2、PRDM5、PRDM16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)PRDM2、PRDM5、PRDM16基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　3、移植瘤研究部分:體外培養(yǎng)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞，MSP檢測(cè)PRDM5基因甲基化狀態(tài)，然后用不同濃度的5-aza-2dC對(duì)SK-MES-1細(xì)

5、胞進(jìn)行去甲基化處理，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。22只雄性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和5-aza-2dC治療組，每組11只，皮下接種SK-MES-1細(xì)胞，待移植瘤短徑達(dá)0.5cm時(shí)，治療組施以5-aza-2dC腹腔注射治療，對(duì)照組行磷酸鹽緩沖液腹腔注射對(duì)照處理，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。4周后取出移植瘤稱重，利用MSP、RT-PCR、Western-blot方法分別檢測(cè)PRDM5基因甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:

6、
　　1、臨床標(biāo)本研究部分:(1) PRDM1、PRDM2、PRDM5、PRDM6、PRDM10、PRDM14、PRDM15、PRDM16基因在肺鱗癌和肺腺癌的腫瘤組織、癌旁組織和遠(yuǎn)處肺組織均有mRNA表達(dá)，其中PRDM2 mRNA、PRDM5 mRNA、PRDM16 mRNA在腫瘤組織表達(dá)降低或缺失。(2)肺鱗癌患者腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)處對(duì)照組織PRDM2基因甲基化頻率分別為67.3％、50.0％、17.3％，PRDM5基因甲

7、基化頻率分別為73.1％、44.2％、21.1％，PRDM16基因甲基化頻率分別為80.8％、40.4％、21.2％;肺腺癌患者腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)處對(duì)照組織PRDM2基因甲基化頻率分別為，78.3％、34.8％、21.7％，PRDM5基因甲基化頻率分別為82.6％、47.8％、17.4％，PRDM16基因甲基化頻率分別為82.6％、52.2％、30.4％;腫瘤組織甲基化頻率顯著高于遠(yuǎn)處對(duì)照組織，癌旁組織介于腫瘤組織和遠(yuǎn)處對(duì)照組織之間

8、。(3)肺鱗癌和肺腺癌患者癌旁組織PRDM2、PRDM5、PRDM16蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于腫瘤組織，遠(yuǎn)處肺組織PRDM2、PRDM5、PRDM16蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于癌旁組織。(4)在所有組織標(biāo)本中，PRDM2、PRDM5、PRDM16基因完全甲基化的標(biāo)本均未能檢測(cè)到mRNA和蛋白質(zhì);按照肺鱗癌、肺腺癌以及腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)處肺組織將標(biāo)本分為6個(gè)亞組，每個(gè)亞組內(nèi)PRDM2、PRDM5、PRDM16基因部分甲基化標(biāo)本的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)

9、水平均低于未甲基化標(biāo)本。(5)腫瘤組織PRDM2、PRDM5、PRDM16基因甲基化與肺癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析結(jié)果顯示:PRDM2和PRDM16基因甲基化與肺鱗癌患者是否吸煙相關(guān)，吸煙者甲基化比例更高;PRDM5基因甲基化狀態(tài)與肺鱗癌患者腫瘤分化程度相關(guān)，低分化鱗癌甲基化比例更高。
　　2、腫瘤細(xì)胞系研究部分:(1)5-aza-2dC處理對(duì)A549和HTB-182和HBE細(xì)胞都表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，但是對(duì)A549和HTB-18

10、2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)強(qiáng)于HBE細(xì)胞。(2)對(duì)照組HBE細(xì)胞PRDM2、PRDM5、PRDM16基因存在低度甲基化，5-aza-2dC處理對(duì)以上3個(gè)基因的甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平無明顯影響。(3)對(duì)照組HTB-182和A549細(xì)胞PRDM2、PRDM5、PRDM16基因處于高甲基化狀態(tài)，5-aza-2dC處理能夠濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)PRDM2、PRDM5、PRDM16基因的甲基化狀態(tài)，并上調(diào)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，HTB-182

11、細(xì)胞對(duì)5-aza-2dC處理的敏感性強(qiáng)于A549細(xì)胞。
　　3、移植瘤研究部分:(1) SK-MES-1細(xì)胞PRDM5基因存在甲基化。(2)5-aza-2dC處理對(duì)SK-MES-1細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。(3)裸鼠經(jīng)皮下接種SK-MES-1細(xì)胞后于第5～9d開始成瘤，成瘤率100％。5-aza-2dC治療組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)速度低于對(duì)照組，荷瘤結(jié)束時(shí)治療組移植瘤重量(0.86±0.42 g)顯著低于對(duì)照組(2.03±0.63 g)。(

12、4)對(duì)照組11個(gè)移植瘤中8個(gè)檢測(cè)到PRDM5基因甲基化，5-aza-2dC治療組11個(gè)移植瘤中僅3個(gè)檢測(cè)到PRDM5基因甲基化。(5)5-aza-2dC治療組裸鼠移植瘤組織PRDM5 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)強(qiáng)度分別為0.52±0.10和0.52±0.18，對(duì)照組裸鼠移植瘤組織PRDM5 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)強(qiáng)度分別為0.16±0.11和0.15±0.10，治療組mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組。
　　研究結(jié)論:(