肝細胞癌中3-OST-2基因甲基化的研究.pdf

1、背景:肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，目前針對其早期診斷及分子靶向治療的研究日漸成為研究中的熱點。HCC的形成(和發(fā))展受遺傳學機制(geneticmechanism)和表觀遺傳學機制(epigeneticmechanism)()共同調控，是一種多基因共同參與的級聯(lián)調控過程，最終導致癌基因的激活或抑煽基因的失活。表觀遺傳學指不發(fā)生DNA序列改變的基因表達改變，DNA甲基化和組蛋

2、白修飾是其中的兩個主要內容。近年來研究顯示，人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化異常有關，特異基因的甲基化檢測可以作為癌癥早期診斷的分子標記物、治療的靶點和判斷預后的手段。3-O-硫基轉移酶-2(heparansulfateD-glucososaminyl3-O-sulfotransferase-2，3-OST-2)基因表達缺失致使硫酸乙酰糖蛋白修飾不完全，與腫瘤發(fā)展有密切關系，但是具體機制尚不清楚。DNA甲基化往往與組蛋白修飾相互作用共

3、同調控基因的表達。比之DNA甲基化，組蛋白修飾的調控更為復雜，不同組蛋白中的不同氨基酸可以發(fā)生多種不同類型的修飾，其中組蛋白乙?；腿ヒ阴；墙M蛋白修飾中的重要內容。新近的研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1不僅可通過DNA解螺旋酶識別甲基化位點，在確保DNA甲基化的正確復制中起重要作用，還能識別甲基化的組蛋白，具有雙重識別DNA和組蛋白甲基化的功能，但UHRF1如何調控抑癌基因表達，在肝細胞癌中發(fā)揮怎樣的作用目前尚不清楚。
　　 目的:探討3

4、-OST-2啟動子甲基化在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，檢測DNA甲基化轉移酶(DNAmethyltrasferases，DNMT)抑制劑5-氮雜-2'，脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases，HDAC)抑制劑曲古菌素A(trichostatinA，TSA)對HCC細胞株中3-OST-2基因啟動子區(qū)甲基化水平、基因表達以及對核轉錄因子UHRF1

5、的影響。
　　 方法:培養(yǎng)HCC細胞株，實驗分為4組:(1)未加藥HCC細胞株對照組;(2)5-Aza-dC單獨處理組;(3)TSA單獨處理組;(4)5-Aza-dC+TSA聯(lián)合處理組。采用甲基化特異性PCR(methylation-specificpolymerasechainreaction，MSP)法檢測藥物作用前后HCC細胞株中3-OST-2啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài)改變，實時熒光定量PCR(Real-timepolymera

6、sechainreaction，RT-PCR)法檢測3-OST-2和UHRFlmRNA的表達變化，采用Westernblotting和細胞爬片免疫組化法檢測不同處理組UHRF1蛋白的表達變化。
　　 結果:3-OST-2在HCC細胞株中呈完全甲基化狀態(tài)，5-Aza-dC或TSA單獨均能部分逆轉3-OST-2甲基化，mRNA表達分別增加2.7倍和4.9倍，兩藥聯(lián)合處理后，3-OST-2甲基化被完全逆轉，mRNA表達增加9.1倍。5

7、-Aza-dC或TSA均能降低UHRF-1mRNA和蛋白表達，TSA比5-Aza-dC療效更好(P＜0.01)，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用（P＜0.01）。細胞爬片免疫組化結果顯示，UHRF1蛋白在HCC細胞株中陽性表達率較高(94％)，經(jīng)5-Aza-dC處理后UHRF1蛋白表達陽性率降低為69％;與未加藥HCC細胞株對照組相比，差別在統(tǒng)計學上有意義(P＜0.01)。而TSA處理后UHRF1蛋白表達顯著下降，陽性率為35％，抑制UHRF1蛋白

8、效果明顯好于TSA(P＜0.01);兩種藥物聯(lián)合處理后，UHRF1蛋白陽性率降為27％。Westernblotting結果表明兩種藥物均可抑制UHRF1蛋白表達，兩藥聯(lián)用效果更為明顯。
　　 結論:3-OST-2基因表達降低在HCC中發(fā)揮重要作用。其表達受啟動子區(qū)甲基化和組蛋白去乙酰化共同調控。UHRF1參與了3-OST-2基因表達調控通路中DNA甲基化和組蛋白去乙?；g的相互作用，并且對組蛋白乙?；恼{控作用大于對DNA甲基