miR-125b在胃癌中的表達(dá)與功能研究及其臨床應(yīng)用.pdf

1、背景:胃癌是我國僅次于肺癌死亡率次高的惡性腫瘤，全世界25％的胃癌死亡率在中國，由于胃癌發(fā)現(xiàn)時往往已在第Ⅲ、Ⅳ期，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，五年生存期不到40％，故進(jìn)一步闡明胃癌的分子機制，尋找胃癌理想的早期診斷標(biāo)記物和治療靶點，以達(dá)到早預(yù)防、早診斷、早治療，具有非常深遠(yuǎn)的意義。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA家族，大約21-25個核苷酸，通過調(diào)節(jié)靶基因mRNA的翻譯或降解而起到調(diào)節(jié)基因的作用。在腫瘤中，miRNA通

2、過對下游靶基因的調(diào)節(jié)，對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起到至關(guān)重要的作用，其在腫瘤組織中的差異表達(dá)體現(xiàn)了與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的密切關(guān)系，針對miRNA與腫瘤的相關(guān)研究充分體現(xiàn)了miRNA參與基因調(diào)控的復(fù)雜性，它們調(diào)控的靶基因關(guān)系著腫瘤的分化、增殖、凋亡、侵襲和遷移等各方面。我們先前的實驗發(fā)現(xiàn)在胃癌中同樣有不同的miRNA表達(dá)譜，因此以miRNA作為新的切入點，為研究胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制和靶向治療等領(lǐng)域開辟一條新的途徑。
　　目的:miR-

3、125b作為癌基因型或抑癌基因型在不同的腫瘤中發(fā)揮重要的作用，然而，其在胃癌中的表達(dá)水平、細(xì)胞生物學(xué)特征、確切的分子機制與臨床應(yīng)用價值未見詳盡的研究與報道。本文旨在通過細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)與臨床大樣本的調(diào)查闡明miR-125b在胃癌中的作用、分子調(diào)節(jié)通路與臨床應(yīng)用價值，以期進(jìn)一步闡明胃癌的分子機制，為早期診斷和靶向治療提供新的分子位點。
　　方法:TRIZOL和miRNAeasy mini kit試劑提取胃癌細(xì)胞系(AGS、MK

4、N-28、BGC-823、HGC-27、SGC-7901和MKN-45)、正常胃上皮細(xì)胞GES和50例胃癌組織及其配對的癌旁非腫瘤胃粘膜組織的miRNAs，按miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，miR-125b和內(nèi)參U6引物購自Qiagen公司，用ABI7500 FAST型實時熒光定量PCR儀進(jìn)行miR-125b在胃癌細(xì)胞株與胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)分析;將5.0×105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)

5、板中，37℃、5％ CO2孵育箱靜置培養(yǎng)24小時，按Lipofectamine2000說明書將miR-125b inhibitor和 Negative Control各2μl(50pmol/μl)轉(zhuǎn)染HGC-27和MKN-28胃癌細(xì)胞株，24小時后用熒光顯微鏡和RT-PCR觀察與檢測轉(zhuǎn)染效率，MTT法、克隆形成實驗和小室穿膜實驗分析miR-125b對胃癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移的作用;RT-PCR和或Western blot檢測m

6、iR-125b預(yù)測下游基因通路PPP1 CA mRNA、PPP1CA蛋白和RB蛋白磷酸化的表達(dá)水平;構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒（PPP1CA wild-type mRNA3'-UTR和PPP1CAmutant-type mRNA3'-UTR）驗證miR-125b與預(yù)測下游靶向基因PPP1CA的相互作用;原位雜交法檢測miR-125b在300例臨床石蠟固定胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，統(tǒng)計學(xué)分析miR-125b表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。<

7、br>　　結(jié)果:miR-125b在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤胃粘膜(0.37±0.23vs0.19±0.13，P＜0.01)，同時伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組(0.47±0.23vs0.25±0.12，P＜0.05);除MKN-45外，miR-125b在胃癌細(xì)胞株AGS、MKN-28、BGC-823、HGC-27、SGC-7901中的表達(dá)高于正常胃上皮細(xì)胞GES的表達(dá)量(P＜0.05）;胃癌細(xì)胞株HGC-27和M

8、KN-28轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物后，轉(zhuǎn)染組HGC-27和MKN-28的細(xì)胞增殖率與克隆形成率顯著低于Negative Control組，HGC-2724h、48h、72h相對的增殖率與克隆形成率分別是59％、55％、52％與48％(P＜0.01)，MKN-2824h、48h、72h相對的增殖率與克隆形成率分別是62％、59％、56％與49％(P＜0.01)，差異具有顯著意義;轉(zhuǎn)染組HGC-27和MKN-28的細(xì)胞侵襲力和遷移力顯著低

9、于Negative Control組，侵襲力和遷移力分別是48％，52％(P＜0.01）和51％，49％(P＜0.01）;胃癌細(xì)胞株HGC-27和MKN-28轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物后，顯著提高了細(xì)胞中PPP1 CA的mRNA(P＜0.01)與蛋白的表達(dá)水平，降低了RB的蛋白磷酸化;熒光素酶分析顯示miR-125b顯著降低了wild-type PPP1CA的相對熒光素酶活性(P＜0.01），但對mutant-type PPP1 CA無

10、明顯差異，表明miR-125b可直接與PPP1CA mRNA3'-UTR區(qū)靶向結(jié)合;原位雜交結(jié)果顯示miR-125b在癌旁非腫瘤胃黏膜組織中陰性表達(dá)，而在58％(174/300)的胃癌組織中高表達(dá)，在42％(126/300)的胃癌組織中低表達(dá);miR-125b的表達(dá)強度與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織分化有關(guān)，而與年齡、性別、部位無關(guān);在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期胃癌中，miR-125b低表達(dá)胃癌患者5年生存率顯著高于高表

11、達(dá)胃癌患者(P＜0.05），但miR-125b的表達(dá)與Ⅳ期胃癌患者5年生存率無關(guān)(P=0.85); Cox多因素回歸分析表明miR-125b表達(dá)是胃癌的獨立預(yù)后因子之一。
　　結(jié)論:
　　1)miR-125b在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中顯著高表達(dá)。
　　2) miR-125b可能是通過靶向作用PPP1CA-RB通路促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲與遷移。
　　3)miR-125b的表達(dá)與胃癌腫瘤大小、浸潤深度、淋