乳腺癌中miR-125b的功能研究及鼻咽癌中LATS2表達(dá)與功能研究.pdf

1、腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下,局部組織的細(xì)胞失去對(duì)生長(zhǎng)的正常調(diào)控,導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物,目前惡性腫瘤是危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程,是在遺傳因素、環(huán)境因素等諸多因素相互協(xié)同作用下,多種遺傳及表觀遺傳學(xué)改變累積的結(jié)果,涉及多種癌基因的激活和/或抑癌基因的失活。盡管目前已有很多研究者對(duì)腫瘤進(jìn)行了廣泛深入的研究,也取得了不少成績(jī),但是腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制目前仍然未能完全闡明。本研究擬從編碼基

2、因和非編碼的小分子RNA角度來(lái)分析其在鼻咽癌和乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,從而為闡明腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并為腫瘤的診斷、預(yù)后判斷以及治療提供潛在的分子靶標(biāo)和策略。
　　 第一章 miR-125b對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響及其分子機(jī)制
　　 研究背景及研究目的：
　　 MicroRNA(miRNA)是一組小分子非編碼RNA,可通過(guò)與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA可通過(guò)促進(jìn)R

3、NA降解、抑制mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控靶基因。預(yù)測(cè)有1/3的編碼基因受到miRNA的調(diào)控。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA的表達(dá)異常參與了多個(gè)生物學(xué)過(guò)程,如發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和分化。miRNA突變和表達(dá)異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程具有重要作用,提示miRNA可能充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)miR-125b在乳腺癌中表達(dá)下調(diào),本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)miR-125b的功能進(jìn)行進(jìn)一步探討。
　　 研究方法：
　　

4、我們將miR-125b的前體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA—MB-435,應(yīng)用real—time PCR和熒光原位雜交的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖,低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的分布,利用microarray確定miR-125b調(diào)控的基因,熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)miR—125b的直接靶基因。
　　 研究結(jié)果：
　　 我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞株MCF-7和

5、MDA-MB-435細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-125b,可以顯著抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成并引起細(xì)胞周期G1期增多,進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)譜分析和western blotting發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR—125b抑制MAN1B1、C9orf86、ETS1和MKNK2蛋白水平。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ETS1是miR-125b的直接靶基因。利用RNAi技術(shù)抑制ETS1的表達(dá)后同樣可觀察到細(xì)胞增殖的抑制、克隆數(shù)目減少以及細(xì)胞周期G1期增多,提示miR-125b可通過(guò)

6、下調(diào)ETS1實(shí)現(xiàn)其抑制增殖、克隆形成以及影響細(xì)胞周期進(jìn)程的功能。這些結(jié)果說(shuō)明miR—125b在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)一個(gè)重要的抑癌基因,可能為乳腺癌的治療策略帶來(lái)新的啟示。
　　 結(jié)論：
　　 miR-125b通過(guò)抑制ETS1的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1增多,提示miR-125b在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用,可能在乳腺癌診斷、預(yù)后判斷以及治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 第二章 LATS2在鼻咽癌組織中

7、的表達(dá)及其細(xì)胞生物學(xué)功能研究
　　 研究背景及研究目的：
　　 LATS2編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶,在中心體復(fù)制和保持基因組穩(wěn)定性具有重要的意義。近來(lái)有報(bào)道LATS2參與腫瘤發(fā)生過(guò)程。在乳腺癌和急性淋巴細(xì)胞白血病中,LATS2 mRNA表達(dá)下調(diào)。然而,LATS2在鼻咽癌中的表達(dá)及功能研究目前還沒(méi)有報(bào)道,本研究以華南地區(qū)NPC人群為研究對(duì)象,分析LATS2的表達(dá)水平與鼻咽癌病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)一步深入探討LAT

8、S2表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能。
　　 研究方法：
　　 應(yīng)用real-time PCR和免疫印跡的方法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮永生化細(xì)胞NP69細(xì)胞中LATS2的表達(dá)水平,應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)220例鼻咽癌組織中LATS2蛋白的表達(dá)情況,并分析LATS2蛋白表達(dá)與病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,應(yīng)用甲基化特異性PCR,我們檢測(cè)LATS2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和CNE2中轉(zhuǎn)染s

9、iRNA抑制LATS2的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：
　　 在220個(gè)病例中,LATS2染色陽(yáng)性的178例,陽(yáng)性率80.91％(178/220),進(jìn)一步分析顯示LATS2表達(dá)水平與NPC病人臨床病理特征無(wú)關(guān),與預(yù)后有關(guān),LATS2高表達(dá)的病人五年生存率(57.23％)顯著低于LATS2低表達(dá)的病人(73.96％),Cox多重回歸分析表明LATS2是鼻咽癌獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。甲基化特異性PCR檢測(cè)顯示30例鼻咽癌組織中11(36

10、.7％)例表現(xiàn)為L(zhǎng)ATS2啟動(dòng)子甲基化,而23例鼻咽粘膜慢性炎組織均表現(xiàn)為L(zhǎng)ATS2啟動(dòng)子甲基化(100％),提示鼻咽癌組織中LATS2高表達(dá)可能是由于其啟動(dòng)子的去甲基化。進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)抑制LATS2表達(dá),結(jié)果顯示抑制LATS2表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期S期增多；在NP69細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LATS2可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：
　　 本研究的結(jié)果揭示了LATS2在促進(jìn)細(xì)胞增殖以及鼻咽癌發(fā)生中的重