黃芪苷Ⅳ防治大鼠腦皮層缺血-再灌注損傷的作用和對APE-Ref-1表達的研究.pdf

1、缺血性腦血管病(Ischemiccerebralvasculardisease，ICVD)是導致人類嚴重、長期能力喪失的主要原因。雖然溶栓治療是最有效的治療方法，但由于并發(fā)的缺血-再灌注損傷使該治療不能達到預期效果。為了減少腦缺血-再灌注損傷，必須充分了解神經(jīng)細胞損傷和修復的機制以能開發(fā)設計出有效的臨床治療方法及藥物的可能作用靶點。有很多的證據(jù)顯示自由基是導致腦缺血-再灌注后組織損傷的重要介質，因此清除自由基的藥物非常適用于治療腦缺血-

2、再灌注損傷。黃芪苷Ⅳ(AstragalosideⅣ,AST)是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分，體外研究中發(fā)現(xiàn)它能清除氧自由基，有望開發(fā)成治療腦缺血-再灌注損傷的藥物。AST對大鼠腦缺血-再灌注后海馬的神經(jīng)保護作用已在我室的前期實驗中得到證實，AST對腦缺血-再灌注后皮質的作用及機制是本課題的研究方向。 在課題的第一部分中，32只健康大鼠被隨機分為4個實驗組：缺血-再灌注模型組(M組)(n=10)，低劑量治療組(AST1)(n=10)

3、，高劑量治療組(AST2)(n=10)，假手術組(Sham)(n=2)。低、高劑量治療組大鼠在缺血前30min腹腔注射AST1mg/kg、4mg/kg，模型組大鼠缺血缺血前30min腹腔注射與治療藥物等劑量的生理鹽水，假手術組大鼠不誘發(fā)缺血-再灌注損傷。在課題的第二部分，32只健康大鼠被隨機分為上述4個實驗組(每組n=8)。所有接受手術的鼠均采用線栓法制備局灶性大腦中動脈阻塞模型(Middlecerebralarteryocclusio

4、n，MCAO)，尼龍絲線送至大腦中動脈造成局灶性缺血，絲線在血管中存留1h，而后拔除絲線引發(fā)再灌注。 第一部分實驗檢測AST對腦缺血-再灌注損傷的保護作用，再灌注后6h處死大鼠前進行神經(jīng)行為評分評價神經(jīng)功能，應用TTC染色法檢測腦梗塞范圍，HE染色觀察病理變化。實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，AST1或AST2組可明顯改善大鼠的神經(jīng)缺損癥狀，AST1和AST2組可明顯降低神經(jīng)行為學評分(6.20±1.03、4.10±0.99vs7.80

5、±1.03，P＜0.01)。AST在1mg/kg和4mg/kg劑量時可有效減少梗塞范圍(15.66±4.43％、7.77±2.55％vs20.77±4.56％，P＜0.05)。AST1與AST2兩組比較在降低神經(jīng)行為評分和梗塞范圍上亦具有顯著性差異，4mg/kgAST比1mg/kgAST更有效。模型組大鼠再灌注6h后腦皮質HE染色可見梗塞灶，中間有炎性細胞浸潤，并有缺血性變性細胞，在AST低劑量治療組可見噬神經(jīng)細胞及變性細胞，但無明顯梗

6、塞灶，AST高劑量治療組無明顯變性及壞死細胞。 第二部分實驗探討AST抗腦缺血-再灌注損傷機制是否與其抗氧化特性有關，檢測指標為脂質過氧化標志物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)的活力。模型組大鼠缺血-再灌注后大腦皮質組織中MDA比假手術組大鼠明顯升高(6.11±0.60vs4.71±0.65nmol/mgprot，P＜0.01)，1m

7、g/kg和4mg/kgAST治療組大鼠MDA含量的升高明顯減弱(5.44±0.58vs6.11±0.60nmol/mgprot，P＜0.05；4.98±0.76％vs6.11±0.60nmol/mgprot，P＜0.01)。與此抗氧化作用一致，AST在1mg/kg和4mg/kg的劑量時可以減弱SOD活力的降低。模型組大鼠缺血-再灌注后皮質SOD活力比假手術組大鼠明顯降低(42.76±5.45vs62.08±8.59U/mgprot，P＜

8、0.01)，而在AST1和AST2組，SOD活力顯著升高(51.09±7.43vs42.76±5.45U/mgprot，P＜0.05；56.11±7.02vs42.76±5.45U/mgprot，P＜0.01)，AST1和AST2組之間無差異。 為探索AST在治療腦缺血-再灌注損傷中的可能藥物作用靶點，第三和第四部分實驗應用免疫組織化學方法和Westernblot檢測無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子1(Apurinic/a

9、pyrimidinicendonuclease/redox-factor1，APE/Ref-1)在缺血-再灌注后大腦皮質組織中的表達。APE/Ref-1是一種體內(nèi)分布廣泛的多功能蛋白質，通過修復DNA的無嘌呤/無嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)部位參與DNA的堿基切除修復(Baseexcisionrepair,BER)。APE/Ref-1還可通過還原許多轉錄因子的半胱氨酸殘基使之易于與DNA結合而調控真核細胞的基

10、因表達。APE/Ref-1在腦缺血-再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用，它是AST的可能作用靶點。 免疫組織化學實驗顯示假手術組大鼠APE/Ref-1在細胞核和細胞漿均有表達，模型組大鼠再灌注后大腦皮質組織中APE/Ref-1的表達明顯減少，且APE/Ref-1主要在細胞漿表達，給予兩種劑量的AST治療后可明顯減弱APE/Ref-1表達的下降，APE/Ref-1的表達接近于假手術組大鼠，且在細胞核與細胞漿均有表達。Westernblo