APE-Ref-1在大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)調(diào)控及氧化損傷過程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： 聽覺神經(jīng)元損傷是感音神經(jīng)性耳聾的主要原因之一。近年研究發(fā)現(xiàn)耳毒性聾、噪聲性聾、老年性聾以及耳蝸缺血再灌注損傷，都與活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，氧化損傷是內(nèi)耳聽神經(jīng)元損傷的基本病理過程。無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactorl，APE/Ref-1)是一種具有DNA修

2、復(fù)、氧化還原以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的多功能蛋白，盡管有研究表明其在多種細(xì)胞抗氧化損傷過程中起重要的作用，但其在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion cells，SGCs)的表達(dá)及其在氧化損傷過程中的作用并不清楚。本研究對SGCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，并建立體外氧化損傷模型，對APE/Ref-1在體內(nèi)、外螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測，并利用腺病毒載體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)與RNA干擾技術(shù)對APE/Ref-1在SGCs表達(dá)進(jìn)行正、反調(diào)控，研究AP

3、E/Ref-1在螺旋神經(jīng)節(jié)氧化損傷中的作用。為螺旋神經(jīng)節(jié)氧化損傷保護(hù)研究提供理論依據(jù)。 研究目的： 探討APE/Ref-1在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)氧化損傷過程中的作用及其機(jī)制，為螺旋神經(jīng)節(jié)氧化損傷保護(hù)研究提供理論依據(jù)。 研究方法： 1．通過免疫組織化學(xué)技術(shù)初步了解APE/Ref-1蛋白在耳蝸組織的表達(dá)。 2．體外分離并培養(yǎng)大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞48小時后，采用不同濃度H202(0，10,25,50，100,3

4、00μmol/L)干預(yù)1小時，換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，采用MTT方法、TUNEl方法分別檢測螺旋神經(jīng)節(jié)在H<,2>O<,2>氧化環(huán)境下細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡情況。 3．構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-APE/Ref-1，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，通過指示蛋白綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，檢測不同倍數(shù)(MOI)的感染率，以及感染后24h，48h和72h時GFP表達(dá)感染率，確定合適的感染倍數(shù)和病毒表達(dá)時間。 4．采用RT-PC

5、R和Western Blot檢測Ad-APE/Ref-1感染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)APE/Ref-1的mRNA和蛋白表達(dá)。檢測通過腺病毒感染介導(dǎo)能否有效的引起螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過度的表達(dá)APE/Ref-1。采用MTT方法、TUNEL方法分別檢測轉(zhuǎn)染后螺旋神經(jīng)節(jié)在H<,2>O<,2>氧化環(huán)境下的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡情況。 5．構(gòu)建靶向APE/Ref-1基因短發(fā)夾狀干擾RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體PGenes

6、ill-APE/Ref-1，并采用LipofectaminieTM2000脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。根據(jù)綠色熒光指示蛋白估計感染率。 6．采用RT-PCR和Western Blot檢測PGenesill-APE/Ref-1感染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)APE/Ref-1的mRNA和蛋白表達(dá)。檢測通過RNA干擾是否有效的抑制了APE/Ref-1在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)。采用MTT方法、TLINEL方法分別檢測轉(zhuǎn)染后螺旋神經(jīng)節(jié)在H<,2>O

7、<,2>氧化環(huán)境下的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡情況。 研究結(jié)果： 1．APE/Ref-1在大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋韌帶、血管紋、Corti器部位有較高表達(dá)，陽性細(xì)胞成棕黃色。 2．在培養(yǎng)條件下SGCs生長良好，接種24小時后可見典型的雙極神經(jīng)元，極少數(shù)成三極神經(jīng)元。48小時后，SGCs長出較長的突起，培養(yǎng)4天后，SGCs突起進(jìn)一步伸長，交織成網(wǎng)絡(luò)，非神經(jīng)細(xì)胞停止增殖。培養(yǎng)8天后細(xì)胞開始死亡，10天后存活細(xì)胞明顯減少，不能

8、傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后用神經(jīng)元特異烯淳化酶(NSE)抗體進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，大部分SGNs全細(xì)胞呈現(xiàn)紅色免疫熒光，胞核明顯，少數(shù)僅胞體染色。 3．隨H<,2>O<,2>濃度升高，細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降趨勢，H<,2>O<,2>濃度為50，100,300uml/L時，OD值分別為0.1917±0.0217，0.1542±0.0165，0.1322±0.0151，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均小于0.01。而細(xì)胞凋亡呈明顯上升趨勢，H<,

9、2>O<,2>濃度為50,100,300uml/L時，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率分別為14.41±1.68％，25.52±1.71％，43.51±2.13％，與對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均小于0.01。 4．通過同源重組，在AD293細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了具有感染能力的Ad-APE/Ref-1腺病毒顆粒；通過反復(fù)感染過程，獲得較高滴度腺病毒液。 5．Ad-APE/Ref-1、Ad-GFP感染SGCs后，GFP表達(dá)陽性隨MOI和

10、時間增加而增加；MOI到達(dá)150以上時，細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到90％以上，感染48小時后，GFP陽性表達(dá)趨于穩(wěn)定，因此確定感染48小時后作為進(jìn)行后續(xù)實驗的適宜時間。 6．RT-PCR和Wetem Blot結(jié)果顯示，攜帶外源基因APE/Ref-1的腺病毒后，SGCs能夠過度表達(dá)APE/Ref-1的mRNA和蛋白。 7．MTT結(jié)果顯示：APE/Ref-1在SGCs過表達(dá)后，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在H<,2>O<,2>(50，100，3

11、00μmol/L)氧化環(huán)境中細(xì)胞活性相對于對照組顯著升高(P<0.01)。而細(xì)胞凋亡相對于對照組成下降趨勢。(P<0.01)。 8．在大鼠APE/Ref-1全長序列中選取含21個核苷酸靶序列，設(shè)計形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表達(dá)載體pGenesil-1中，獲得可靶向抑制APE/Ref-1基因的重組shRNA(short laairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體PGenesill-APE/Ref-1。

12、 9．采用Lipofectamine<'TM>2000脂質(zhì)體將PGenesill-APE/Ref-1轉(zhuǎn)染到螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，RT-PCR和Wetem Blot結(jié)果顯示，APE/Ref-1在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)受到抑制，約40～50％。 10．APE/Ref-1在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)受到抑制后，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在H<,2>O<,2>(25，50，100,300μmol/L)氧化環(huán)境中細(xì)胞活性相對于對照組顯著降低。而細(xì)

13、胞凋亡相對于對照組成上升趨勢，有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。 結(jié)論： 1．APE/Ref-1在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋韌帶、血管紋、Corti器部位有較高水平的表達(dá)。 2．成功分離并培養(yǎng)出大鼠SGCs，通過不同濃度H<,2>O<,2>誘導(dǎo)SGCs氧化損傷，建立了SGCs體外氧化損傷模型。 3．成功構(gòu)建了腺病毒載體Ad-APE/Ref-1。 4．通過重組腺病毒介導(dǎo)，SGCs細(xì)胞內(nèi)APE/Ref-1過度表達(dá)

14、能夠顯著提高SGCs的抗氧化能力，提示APE/Ref-1過表達(dá)對SGCs細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。 5．成功構(gòu)建了靶向抑制APE/Ref-1基因的重組shRNA表達(dá)載體PGenesill-APE/Ref-1。 6．通過RNA干擾，抑制SGCs細(xì)胞APE/Ref-1蛋白表達(dá)能夠降低螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的抗氧化能力，提示APE/Ref-1對SGCs在氧化環(huán)境中的存活起著關(guān)鍵作用。 7．APE/Ref-1對SGCs的氧化損傷保