CIK細(xì)胞對(duì)淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗腫瘤作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 過繼性細(xì)胞免疫治療(Adoptive cellular immu-notherapy,ACI)是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(特異性的和非特異性的),以直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞,從而達(dá)到治療腫瘤目的的一種生物治療方法。近年來,由于綜合治療的合理應(yīng)用,相當(dāng)一部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或緩解,但患者由于長(zhǎng)期化療導(dǎo)致全身情況較差,且出現(xiàn)干細(xì)胞受損,外周血管損傷,患者耐受性差,需尋求新的治療

2、手段。目前,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells,CIK)過繼免疫治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn),國(guó)內(nèi)外諸多報(bào)道顯示其對(duì)多種惡性腫瘤均有一定的療效,是一種很有潛力的免疫細(xì)胞治療方法。CIK細(xì)胞是一種增殖速度快,殺瘤活性高,殺瘤譜廣的高效免疫活性細(xì)胞,并且對(duì)正常造血影響輕微,對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變及骨髓凈化都具有良好效果。迄今為止,CIK細(xì)胞對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株作用的基礎(chǔ)研究及在淋巴瘤的臨床應(yīng)

3、用的報(bào)道較多,但在淋巴瘤荷瘤鼠體內(nèi)研究尚少。本試驗(yàn)通過檢測(cè)應(yīng)用CIK處理前后Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的變化,CIK處理前后荷瘤鼠瘤體大小的變化、荷瘤鼠瘤組織bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)的差異,研究觀察CIK細(xì)胞對(duì)淋巴瘤荷瘤鼠的抑制作用,并探討其作用機(jī)制,為CIK細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng):將Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞加入含10％FBS的

4、1640培養(yǎng)基懸浮,置于37℃、5％CO2,飽和濕度條件下傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2 CIK細(xì)胞的制備及體外擴(kuò)增:取正常人的外周肝素抗凝血,經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral bloodMononuclear cell,PBMC),依據(jù)不同時(shí)間分別加入γ-干擾素(IFN-γ)、抗CD3單克隆抗體(Anti-CD3Mcab)、白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)等細(xì)胞因子,體外誘

5、導(dǎo)成CIK細(xì)胞。以上培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。三天換液時(shí)取少量細(xì)胞懸液使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并制作增殖曲線。
　　 3 MTT法測(cè)定CIK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷作用:將CIK細(xì)胞與Raji細(xì)胞以不同效靶比(E:T分別為10:1、20:1、40:1),加入96孔板,每組3復(fù)孔,常規(guī)設(shè)相應(yīng)空白對(duì)照,培養(yǎng)24、48小時(shí)后,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定分光光度值(OD),計(jì)算殺傷活性。
　　 4建立荷瘤裸鼠模型并分組:在Ba

6、lb/c-nu/nu裸小鼠腋下接種Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞1×107ml,0.2ml/只,建立淋巴瘤裸鼠模型。每3天定時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤大小,記錄長(zhǎng)徑和短徑,按公式(體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2)計(jì)算腫瘤體積大小并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。裸鼠成瘤后,將荷瘤鼠隨機(jī)分為A、B、C3組(每組各5只):A為生理鹽水對(duì)照組,B、C均為CIK細(xì)胞治療組,分別在瘤旁注射體外培養(yǎng)14天的CIK細(xì)胞,注射量分別為2×107/0.2ml/只,4×107/0

7、.2ml/只,每組均隔日一次,共三次。
　　 5殺鼠取瘤并進(jìn)行相應(yīng)項(xiàng)目的檢測(cè):第7天裸鼠頸椎脫臼處死,剝離腫瘤塊并稱重,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小,并計(jì)算腫瘤的體積,計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。機(jī)械法處理腫瘤制成單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率,并測(cè)定bcl-2、Ki-67蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1 CIK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞有明顯殺傷作用,不同效靶比(10:1,20:1,40:1)的CIK細(xì)胞與Raji細(xì)

8、胞共同作用不同時(shí)間(24h,48h)后,OD值均有不同程度減少,且隨著CIK細(xì)胞濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng),OD值逐漸減小,而CIK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷作用隨之增加,作用時(shí)間為24h時(shí)CIK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞殺傷活性分別為(15.7±1.4)％、(33.8±2.3)％、(49.2±2.1)％；作用時(shí)間為48h時(shí)殺傷活性分別為(27.9±1.7)％、(59.3±2.0)％、(78.3±1.6)％。相同作用時(shí)間不同效靶比之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義(P<0.05),同一效靶比不同作用時(shí)間之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)。
　　 2與生理鹽水對(duì)照組相比,CIK細(xì)胞治療組荷瘤鼠瘤體均較前縮小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B組抑瘤率為(23.7±0.56)％,C組抑瘤率為(54.3±0.68)％,試驗(yàn)組(B、C)與對(duì)照組(A)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),試驗(yàn)組(B、C)組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3荷瘤鼠移植瘤細(xì)胞經(jīng)不同密

10、度的CIK細(xì)胞(0、2×107/0.2ml、4×107/0.2ml)作用后,G0/G1期細(xì)胞比例隨CIK細(xì)胞數(shù)目的增加逐漸增加(所占百分比分別為28.56±1.69、34.41±0.34、53.43±1.87),同時(shí)S期及G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少,S期所占比例分別為(52.66±4.60)％、(49.62±1.22)％、(34.87±0.67)％,G2/M期所占比例分別為(17.87±0.49)％、(15.43±0.44)％、(11.

11、97±1.23)％,由此得出移植瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)也隨之逐漸降低,A、B、C各組PI分別為(72.18±3.32)％、(64.40±1.31)％、(46.91±0.69)％,試驗(yàn)組(B、C)移植瘤細(xì)胞各期所占比例及PI分別與對(duì)照組(A)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),試驗(yàn)組(B、C)組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4移植瘤細(xì)胞經(jīng)不同密度的CIK細(xì)胞(0,2×107/0.2ml,4×107/0.2

12、ml)作用后,FCM檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示對(duì)照組未見明顯的凋亡峰,試驗(yàn)組(B、C)經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰,隨CIK細(xì)胞密度的增加,凋亡峰值增加,細(xì)胞凋亡率增高,凋亡率分別為(6.19±1.16)％、(13.17±0.17)％,與對(duì)照組(0.94±0.87)％相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 5經(jīng)過不同密度CIK細(xì)胞作用后,由FCM測(cè)得移植瘤細(xì)胞bcl-2蛋白熒光指數(shù)(FI)分別為A:1.00±0.01

13、、B:0.96±0.01、C:0.87±0.02。Ki-67蛋白熒光指數(shù)(FI)分別為A:1.00±0.01、B:0.95±0.01、C:0.83±0.02,由此可見移植瘤細(xì)胞bcl-2蛋白及Ki-67蛋白表達(dá)均較對(duì)照組下降,二者與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；CIK細(xì)胞治療組間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1 CIK細(xì)胞對(duì)Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞有殺傷活性；且此殺傷活性與

14、CIK細(xì)胞數(shù)量、共培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān),有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系；
　　 2體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)正常人CIK細(xì)胞可有效抑制Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植模型瘤體的生長(zhǎng)；
　　 3 CIK細(xì)胞能夠影響淋巴瘤移植瘤細(xì)胞周期分布,引起G0/G1期阻滯,從而阻止瘤細(xì)胞進(jìn)入分裂相,使增殖減慢,并且CIK細(xì)胞還可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;
　　 4 CIK細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)Raji細(xì)胞的抑制作用與抑制bcl-2、Ki-6