臍血CIK細胞對非霍奇金淋巴瘤的體外殺傷作用及機制的研究.pdf

1、目的:惡性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是原發(fā)于淋巴結和(或)結外淋巴組織的惡性腫瘤,其發(fā)生大多與免疫應答過程中淋巴細胞增殖分化產生的某種免疫細胞惡變有關,是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。由于遺傳因素、環(huán)境中物理及化學因素等的影響,兒童惡性淋巴瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴重威脅著兒童的健康與生命。小兒惡性淋巴瘤無論在臨床表現(xiàn)、組織病理類型還是治療反應上均與成人惡性淋巴瘤不同,有其獨特的生物學特性,如:潛伏期短、生長迅速、侵襲性

2、強等。目前聯(lián)合化療仍是治療惡性淋巴瘤的主要手段,但化療的毒副作用以及多藥耐藥是影響患兒長期生存的重要因素之一。多種靶向藥物的問世如利妥昔單抗(Anti-CD20)、Anti-CD22單抗,它們的臨床應用提高了B細胞型淋巴瘤的緩解率。T細胞型淋巴瘤目前尚未發(fā)現(xiàn)靶向藥物,臨床預后仍較差。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells CIK)是一種新型的免疫活性細胞,是將人外周血單個核細胞在體外多種細胞因

3、子刺激下,獲得的一群異質細胞,同時兼具有T淋巴細胞的強大抗瘤活性和自然殺傷細胞(natural killer cell NK)的非主要組織相容性復合體(major histocompatibility complexMHC)限制殺瘤兩種特點。Survivin是凋亡蛋白抑制劑(Inhibitor of apoptosis protein,lAP)家族中的成員之一,具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞周期和分裂的功能。Livin是最近發(fā)現(xiàn)的一個凋亡抑

4、制蛋白家族的新成員,是獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。Livin主要存在于細胞質中,且以絲狀形式表達,同時也在細胞核中表達。Livin是通過以下途徑來完成抗凋亡作用的:
　　 ①通過拮抗死亡受體途徑;
　　 ②抗化療藥物介導的細胞凋亡作用;
　　 ③抗線粒體介導的凋亡作用。
　　 Livin可以通過直接與Caspases結合來抑制其活性,拮抗細胞凋亡,還可以分解Smac,從而阻止其對XIAP的拮抗作用,間接

5、抑制Caspases來調控細胞的凋亡。研究表明,Livin在正常成人組織如脾、胸腺、前列腺、睪丸、小腸、結腸、卵巢、肝、肺、腦、骨骼肌和淋巴細胞以及外周血中不表達或低表達,大多數(shù)腫瘤中高表達,如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、黑色素瘤和白血病等。
　　 本實驗通過研究臍血CIK細胞對Livin、Survivin的影響進而研究其抗腫瘤作用可能的分子機制,為臍血CIK細胞治療惡性淋巴瘤的臨床應用提供理論

6、依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)T細胞淋巴瘤Jurkat細胞及臍血CIK細胞,分為阿糖胞苷組、臍血CIK細胞組、阿糖胞苷聯(lián)合臍血CIK細胞組、對照組。應用RT-PCR法檢測腫瘤細胞特異性凋亡蛋白Livin、Survivin mRNA的表達水平;MTT比色法檢測殺傷率;流式細胞術(FCM)檢測培養(yǎng)臍血CIK細胞的上清液與Jurkat細胞作用后的凋亡情況。
　　 計量資料采用均數(shù)±標準差((X)±S)表示,實驗數(shù)據(jù)用SPSS13

7、.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),各組間兩兩比較采用SNK法(Student-Newman-Keuls),檢驗水平α=0.05,P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、RT-PCR檢測結果顯示:CIK細胞、阿糖胞苷作用于Jurkat細胞24h、48h后,腫瘤細胞的特異性凋亡抑制因子Livin、Survivin的mRNA表達量均低于對照組,其中CIK細胞聯(lián)合阿糖胞苷組

8、明顯低于對照組,且48h后各實驗組Livin-αA值/β-actin A值、Livin-βA值/β-actinA值、SurvivinA值/β-actin A值均小于24h的比值(A為電泳條帶的灰度值)具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。說明CIK細胞通過下調凋亡抑制因子Livin、Survivin的mRNA表達來促進Jurkat細胞的凋亡,并呈時間依賴性。
　　 2、MTT比色試驗結果顯示:預實驗CIK細胞與Jurkat細胞效靶比5

9、∶1、10∶1、15∶1、20∶1作用12、24,48h后,與對照組相比,各組吸光度值(OD)均有不同程度的下降。各實驗組與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。即CIK細胞作用于Jurkat細胞后隨著效靶比增高及作用時間的延長,CIK細胞對Jurkat的殺傷作用逐漸增強,呈濃度-時間依賴性。實驗組顯示阿糖胞苷10μmol/L、CIK細胞(效靶比:20∶1)、阿糖胞苷10μmol/L聯(lián)合CIK細胞(效靶比:20∶1),各組吸光度(O

10、D)均有不同程度的下降,其中阿糖胞苷聯(lián)合CIK細胞組吸光度下降最明顯,各實驗組與對照組均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),殺傷率的計算結果顯示阿糖胞苷聯(lián)合臍血-CIK組最高達(61.23±4.6)％,是單用阿糖胞苷的1.41倍,是單用CIK組的1.34倍(P＜0.05)。
　　 3、流式細胞術檢測結果顯示:鏡下觀察見Jurkat細胞,與CIK細胞上清液共同培養(yǎng)12h后,有少部分淋巴瘤細胞出現(xiàn)皺縮、凋亡,而24h后出現(xiàn)凋亡峰,48h后

11、淋巴瘤細胞凋亡數(shù)明顯增多,對照組未出現(xiàn)凋亡峰。與對照組相比,實驗組腫瘤細胞凋亡率顯著增高(P＜0.05),24h凋亡率為(31.2±2.9)％,48h凋亡率為(38.6±3.6)％,實驗組間比較,隨作用時間的延長,凋亡率呈上升趨勢,組間差異顯著(P＜0.05)。表明CIK細胞可通過釋放到胞外的各種細胞因子誘導細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞,且呈時間依賴性。
　　 結論:
　　 1、臍血CIK細胞能夠誘導淋巴瘤Jurkat細胞凋亡

12、,并可使Jurkat細胞中Livin、Survivin mRNA的表達下降,并呈明顯的時間依賴關系,認為臍血CIK通過下調Livin、Survivin的表達來促進淋巴瘤細胞的凋亡。
　　 2、臍血CIK細胞體外對T淋巴瘤細胞(Jurkat細胞株)生長具有明顯的抑制作用,且在效靶比在5∶1-20∶1范圍內呈時間、劑量依賴性。
　　 3、臍血CIK細胞通過釋放細胞因子來誘導殺傷Jurkat細胞,且呈時間依賴性。