內(nèi)皮抑素抑制Namalwa淋巴瘤裸鼠移植瘤腫瘤血管生成的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:1.了解內(nèi)皮抑素對(duì)Namalwa淋巴瘤裸鼠移植瘤生長和腫瘤血管生成的抑制作用。2.初步探討內(nèi)皮抑素減少Namalwa淋巴瘤移植瘤腫瘤血管生成和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞叉頭框蛋白O1表達(dá)的關(guān)系。
　　方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):皮下注射Namalwa淋巴瘤細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型。在植瘤后第11天開始分組干預(yù),每天分別于腹腔內(nèi)注射內(nèi)皮抑素2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg;陽性對(duì)照組注射環(huán)磷酰胺75mg/kg,每2天1次,共3次;陰

2、性對(duì)照組每天注射同容積生理鹽水。每2天測(cè)量一次腫瘤的最大垂直徑,按長×寬～2×0.52計(jì)算腫瘤體積,比較各組相對(duì)腫瘤體積(干預(yù)后腫瘤體積/干預(yù)前腫瘤體積),并計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率。任一內(nèi)皮抑素組出現(xiàn)抑瘤作用時(shí)停止干預(yù),處死荷瘤裸鼠,分離腫瘤組織,進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31免疫組化染色和微血管密度計(jì)數(shù)。2.體外實(shí)驗(yàn):小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別與0μg/ml、20μg/ml和80μg/ml內(nèi)皮抑素在體外共培養(yǎng)16小時(shí),用transwell小室觀察細(xì)

3、胞遷移能力,XTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性,RT-PCR和westernblot測(cè)定細(xì)胞叉頭框蛋白O1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。3.離體實(shí)驗(yàn):建立Namalwa淋巴瘤裸鼠移植瘤模型后,分別注射有效劑量的內(nèi)皮抑素(根據(jù)第一部分研究決定干預(yù)方案)和生理鹽水,干預(yù)結(jié)束分離腫瘤組織,用磁珠分選CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞,比較其叉頭框蛋白O1表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.移植瘤成瘤率100％,各組成瘤時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.523),干預(yù)過程

4、中各組荷瘤裸鼠未發(fā)生死亡。2.干預(yù)6天后,各組相對(duì)腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185);干預(yù)8天后,環(huán)磷酰胺組相對(duì)腫瘤體積小于生理鹽水組(P=0.003);干預(yù)12天后,5mg/kg/d內(nèi)皮抑素組相對(duì)腫瘤體積小于生理鹽水組(P=0.027),腫瘤相對(duì)增殖率為64.2%;而2.5mg/kg/d、10mg/kg/d組和生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.693和0.604,腫瘤相對(duì)增殖率分別為87.4%和85.9%。3.干預(yù)12

5、天后,5mg/kg/d內(nèi)皮抑素組相對(duì)腫瘤體積大于環(huán)磷酰胺組(P=0.046),后者腫瘤相對(duì)增殖率為38.4%。4.干預(yù)12天后,5mg/kg/d內(nèi)皮抑素組腫瘤組織微血管密度計(jì)數(shù)少于生理鹽水對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006),而2.5mg/kg/d和10mg/kg/d組與生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.468和0.220。5.內(nèi)皮抑素干預(yù)16小時(shí)后小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)減少,該作用隨內(nèi)皮抑素作用濃度提高而增加(P=0.

6、000)。相應(yīng)濃度干預(yù)后微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.484)6.與抑制遷移對(duì)應(yīng),內(nèi)皮抑素干預(yù)16小時(shí)后上調(diào)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞株叉頭框蛋白O1的mRNA和總蛋白表達(dá)水平(P<0.05),磷酸化蛋白表達(dá)水平無變化(P=0.943),以非磷酸化叉頭框蛋白O1表達(dá)上調(diào)為主,該作用隨內(nèi)皮抑素濃度提高而增加。7.移植瘤組織的細(xì)胞懸液經(jīng)磁珠陽性分選前后CD31陽性細(xì)胞分別為17.2%和90.9%,血管內(nèi)皮細(xì)胞得到純化。8.5mg/

7、kg/d內(nèi)皮抑素干預(yù)12天后的移植瘤組織CD31陽性細(xì)胞磷酸化叉頭框蛋白O1表達(dá)水平和生理鹽水對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.896),總叉頭框O1蛋白表達(dá)高于生理鹽水對(duì)照組(P=0.047),以非磷酸化叉頭框01蛋白表達(dá)升高為主;而未和磁珠結(jié)合的CD31陰性細(xì)胞無該蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:1.內(nèi)皮抑素可抑制Namalwa淋巴瘤裸鼠移植瘤生長,即使腫瘤負(fù)荷較大,抑瘤作用仍顯著。2.內(nèi)皮抑素發(fā)揮抑瘤作用需要合適的劑量,過高或過低劑量的